Protokolle zur Hefetransformation

Einleitung

Hefen gelten als Modellsysteme für eukaryotische Studien, da sie ein schnelles Wachstum aufweisen und über dispergierte Zellen verfügen. Außerdem lassen sich Hefezellen mit der Stempeltechnik relativ leicht vermehren und Mutanten isolieren. Darüber hinaus verfügen sie über ein gut definiertes genetisches System. Vor allem aber verfügen Hefen über ein äußerst vielseitiges DNA-Transformationssystem, das effektiv für die Proteinherstellung genutzt werden kann.

Hefetransformation

Tabelle 1 Sigma-Aldrich Hefetransformationsprodukte

Bestellnummer	Beschreibung	Anwendung	Merkmale/Vorteile
HEFE1	Hefe-Transformationskit. Das Produkt enthält: 10 μg Kontroll-Hefeplasmid-DNA, pRS316 100 ml PLATE-Puffer 100 ml Transformationspuffer	Geeignet für die Transformation eines beliebigen Hefestamms. Bequem, flexibel und empfindlich, positive Transformanten können mit nur 10 ng DNA erzielt werden; die optimale Effizienz liegt im Bereich von 0,1-3 μg.	Einfach und gebrauchsfertig Nur 10 ng Plasmid-DNA erforderlich Flexibilität für jeden Hefestamm  Ausreichend für über 100 Standardtransformationen
L4158	Lithiumacetat-Dihydrat	Erleichterung der Hefetransfektion	Teil der BioXtra-Produktlinie
T9285	Tris-EDTA-Pufferlösung TE-Puffer enthält 1 M Tris-HCl (pH ~8,0), das 0,1 M EDTA enthält.	TE (Tris EDTA)-Puffer wird häufig in Laboren für Molekularbiologie verwendet. TE löst DNA und RNA auf und schützt sie gleichzeitig vor Abbau	Geeignet für die Lagerung von RNA und DNA, einschließlich aufgereinigter Plasmid-DNA-Bestände
D8418	Dimethylsulfoxid (DMSO)	Kann u. a. für die Vorbereitung von Puffern für die Transformation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion von Zellen und Zellfusionsverfahren mit 40–50 % PEG verwendet werden	Durch das Produkt kann die Transformationseffizienz um das 2- bis 5-fache erhöht werden Dieses Produkt ist DNase-frei, RNase-frei, Phosphatase- und Protease-frei.
D9156	Desoxyribonukleinsäure (DNA), einzelsträngig aus Lachshoden	Kann für Hefetransformationen verwendet werden	Diese DNA wird mit Ethanol ausgefällt und beschallt, um einzelsträngige Fragmente zu erzeugen, die mit den 587- und 831-Basenpaar-Markerfragmenten co-migrieren

Protokoll zur Hefetransformation

Protokollüberblick

Die LiAc-Transformationsmethode umfasst drei Hauptschritte: Vorbereitung kompetenter Hefezellen, Transformation mit Plasmid-DNA und anschließendes Ausbringen zur Selektion der Transformanten. Hefetransformanten werden in der Regel mit Hilfe von auxotrophen Markern selektiert; daher wird für das Screening von Transformanten das entsprechende synthetische Ausfallmedium verwendet.

Benötigte Reagenzien:

Stammlösungen
50 % Polyethylenglykol-Lösung (Molgewicht ~36.500)
1 M Tris-HCl und 0,2 M EDTA, pH 8,0 (TE-Puffer) (Bestellnummer T9285)
1 M Lithiumacetat, pH 7,5 (Bestellnummer L4158)

1x TE-LiAc-Lösung
10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mM EDTA und 0,1 M Lithiumacetat

PEG-TE-LiAc-Lösung
40 % PEG in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mM EDTA und 0,1 M Lithiumacetat

Hefetransformation

1. Platten mit YPD und vollsynthetischem (SC) Ausfallmedium vorbereiten und separat autoklavieren (Tabellen 1 und 2).
2. Hefezellen von den Platten in 20 ml YPD-Medium in einem sterilen 100-mL-Kolben inokulieren.
3. Über Nacht unter Schütteln wachsen lassen.
4. Zellen aus vorgenannter Kultur in 100 ml YPD-Medium verdünnen, bis die OD600 0,3 beträgt
5. Zellen vorsichtig pelletieren.
6. In 7-8 ml 1x TE-LiAc-Lösung resuspendieren und bei 23 °C 1–1,5 Stunden rotieren lassen.
7. 10 µl von 10 mg/ml Lachshoden-DNA (Bestellnummer D9156) in sterile Mikrozentrifugenröhrchen geben, die für die Transformation bestimmt sind, und in ein Röhrchen für die Negativkontrolle.
8. 0,1 µg Hefeplasmid-DNA (die untersucht werden soll) in jedes Röhrchen und 100 µl kompetente Zellen in jedes Röhrchen geben und dann vortexen.
9. 600 µl der frisch hergestellten PEG-TE-LiAc-Lösung zugeben, vortexen und 30 Minuten bei 30 °C unter Schütteln inkubieren.
10. Optional – DMSO (Bestellnummer D8418) kann zu 10 % (v/v) zugegeben werden; anschließend erfolgt ein Hitzeschock über 15 Minuten bei 42 °C.
11. 3 Sekunden schleudern, die Zellen in sterilem Wasser resuspendieren und mit einem geeigneten vollsynthetischen (SC) Ausfallmedium ausbringen.
    

Hinweis: Siehe Wachstumsprotokolle für das Ausbringen von Hefen und den nachstehenden Abschnitt zur Isolierung von Transformanten.

Isolierung von Hefetransformanten

Hefetransformanten werden in der Regel mit dem URA3-Komplementationsverfahren ausgewählt. Darüber hinaus können auch Techniken, in denen Aminosäuren für die Komplementierung verwendet wird, und Blau-Weiß-Screening-Verfahren eingesetzt werden.

Bei der URA3-basierten Selektionstechnik enthält die Plasmid-DNA eine normale Kopie des URA3-Gens der Hefe sowie den URA3-Promoter, während dem mutierten Hefestamm das URA3-Allel fehlt. Die mit dem Plasmid transformierten Hefezellen verfügen somit über eine funktionelle Kopie des URA3-Gens, die es ihnen ermöglicht, auf synthetischen Hefe-Ausfallmedium-Supplementen ohne Uracil (Bestellnummer Y1501) zu wachsen.

Abbildung 1. Hefetransformation

Literatur

1. Sherman F. 2002. Getting started with yeast.3-41. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50954-x

2. MacDonald PN. 2001. Two-Hybrid Systems. https://doi.org/10.1385/1592592104

3. Treco DA, Winston F. 2008. Growth and Manipulation of Yeast. Current Protocols in Molecular Biology. 82(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1302s82

4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494