Der Transwell Migrations- und Invasionsassay für Endothelzellen

Die Angiogenese ist ein streng regulierter Zellvorgang, der durch pro- und antiangiogene Signale wie Integrine, Chemokine, Angiopoietine, Sauerstoffsensoren, Verbindungsmoleküle und endogene Inhibitoren ausgeglichen wird.⁴ Während die physiologische Angiogenese sehr gut organisiert ist, ist die pathologische Angiogenese weniger gut kontrolliert, da die Gefäße als Reaktion auf Krankheit nur selten reifen, umgestaltet werden oder sich zurückbilden.⁵ Da die Migration und Invasion von Endothelzellen für die Angiogenese von wesentlicher Bedeutung sind, sind die sogenannten Transwell-Zellmigrations- und -invasionsassays hilfreiche Instrumente für die Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen angiogener Ereignisse. Zellmigration kann ganz einfach als der Prozess definiert werden, bei dem sich Zellen durch extrinsische biochemische Signale von einem Ort zum anderen bewegen. Die Zellinvasion hingegen misst die Fähigkeit von Endothelzellen, sich durch eine 3D-Matrix (wie Basalmembranen) zu bewegen. Es handelt sich um einen komplexen mehrstufigen Prozess, der Adhäsion, Proteolyse von EZM-Komponenten, Reorganisation der Mikroumgebung und Migration durch die Matrix umfasst.⁶

Der In-vitro-Transmigrationsassay, auch bekannt als Boyden-Kammer-Assay, wird zur Messung der Migration von Endothelzellen entlang eines Cytokin-Gradienten (Chemotaxis) und zur Messung der chemotaktischen Fähigkeit von Prüfsubstanzen in vitro verwendet. Er besteht aus zwei mit Medium gefüllten Kammern, die durch eine mikroporöse Membran getrennt sind. In der Regel werden die Zellen in die obere Kammer eingebracht und wandern durch die Poren der Membran in die untere Kammer, in der sich chemotaktische Substanzen befinden. Nach einer angemessenen Inkubationszeit wird die Membran zwischen den beiden Kammern fixiert und die Anzahl der Zellen, die auf die untere Seite gewandert sind, bestimmt.

Im in-vitro-Invasionsassay wird die Zellmigration von Endothelzellen durch eine extrazelluläre Matrix gemessen. Die invasive Migration ist ein wichtiger Prozess in der Angiogenese, spielt aber auch bei pathologischen Ereignissen wie der Entwicklung und Metastasierung von Krebs eine bedeutende Rolle.⁹ Wie im Transwell-Migrationsassay werden im Zellinvasionsassay zwei Kammern eingesetzt, die durch eine Membran mit einer genau definierten Porengröße getrennt sind. Die Membran ist von einer Matrix bedeckt, welche die Basalmembran der Blutgefäße imitiert. Ein potenzieller chemotaktischer Faktor wird in eine der Kammern eingebracht, und es entwickelt sich ein Gradient über die Membran. Endothelzellen, die in die andere Kammer eingebracht werden, bauen die Matrix ab und wandern dann an diesem Gradienten entlang. Nach einer angemessenen Inkubationszeit können die Zellen, die durch die Membran migriert sind, gezählt werden, nachdem die Membran fixiert und gefärbt wurde.⁹

Abbildung 1. Workflow Transmigrations- und Invasionsassays für Endothelzellen.

Protokolle für Transwell-Migrations- und Invasionsassays für Endothelzellen

Protokoll Transmigrationsassay

1. Eine Endothelzellenkultur herstellen. PromoCell Endothelzellen mit 5X10³ Zellen/cm² (oder wie im jeweiligen Produkthandbuch empfohlen) in einem geeigneten Kulturgefäß unter Verwendung des empfohlenen Endothel-Wachstumsmediums ausbringen. Das Nährmedium alle 2-3 Tage ersetzen. Die Zellen eine Konfluenz von 70-90 % erreichen lassen.
2. Das Assaymedium vorbereiten. Eine geeignete Menge Assaymedium vorbereiten, indem dem Endothelzellen-Basalmedium 10 % FBS hinzugefügt werden (z. B. 9 ml Basalmedium + 1 ml FBS).
3. Medien und Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Das Assaymedium und die Bestandteile des PromoCell DetachKit 1-2 Stunden bei Raumtemperatur vorwärmen.
4. Das Testmedium vorbereiten. Die Prüfsubstanz im Assaymedium lösen. Pro Well der 24-Well-Platte sollen 750 μl Testmedium eingesetzt werden. Wir empfehlen, ein zusätzliches Testmedium mit 20 ng/ml VEGF oder bFGF als Positivkontrolle herzustellen. Als Negativkontrolle kann ein Assaymedium ohne chemotaktischen Faktor verwendet werden.
5. 24-Well-Platten vorbereiten und Testmedium hinzufügen. Die Zellkultureinsätze in die Wells der 24-Well-Platte einsetzen. 750 μl Testmedium in die äußere Kammer jedes Wells geben.
6. Die Endothelzellen ablösen. Die Endothelzellen sollten zu 70–90 % konfluent sein. Das Medium aus dem Kulturgefäß entnehmen und die Zellen durch Zugabe von 200 μl/cm² PBS (D8537) waschen. Die PBS entfernen und 100 μl/cm² Trypsin/EDTA (T3924) hinzufügen. Das Gefäß verschließen und die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen. Wenn sich die Zellen abzulösen beginnen, vorsichtig an die Seite des Gefäßes klopfen, um die restlichen Zellen zu lösen. Trypsinlösung durch Zugabe von 100 μl/cm² Trypsin-Neutralisationslösung (T6414) neutralisieren und das Kulturgefäß 30 Sekunden vorsichtig schütteln.
7. Die Zellen zählen. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen und das Röhrchen bei 220 x g 4 Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Assaymedium resuspendieren. Die Zellzahl nach den spezifischen Standardverfahren bestimmen.
8. Die Zellen in die Zellkultureinsätze aussäen. Die Zellkonzentration mit Assaymedium auf 1x 10⁵ Zellen/ml verdünnen. Vorsichtig 500 μl der Zellsuspension (= 5x10⁴ Zellen) in die Zellkultureinsätze der 24-Well-Platte geben.
9. Den Transmigrationsversuch starten. Die Zellen in den 24-Well-Platteneinsätzen in einem befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) 3–6 Stunden inkubieren. Während der Inkubationszeit entwickelt sich ein Gradient der Prüfsubstanz über die Membran. Die Zellen migrieren durch die Poren am Gradienten entlang zur Unterseite der Membran und haften dort an.
10. Die nicht migrierten Zellen auf der Oberseite der Membran entfernen. Das Medium vorsichtig aus allen Zellkultureinsätzen entnehmen. Danach die Einsätze mit einer Pinzette entnehmen und das Medium aus jedem Well absaugen. Nach dem erneuten Einsetzen der Einsätze in die Wells die nicht migrierten Zellen von der Oberseite der Membran mit einem Wattestäbchen entfernen. Die PBS in den Spalt zwischen Well und Einsatz pipettieren.
11. Mit Fixierung und Färbung der migrierten Zellen fortfahren.

Protokoll Invasionsassay

1. Eine Endothelzellenkultur herstellen. PromoCell Endothelzellen bei 5x10³ Zellen/cm² in einem geeigneten Kulturgefäß unter Verwendung des empfohlenen Endothelwachstumsmediums ausbringen. Das Nährmedium alle 2-3 Tage ersetzen. Die Zellen eine Konfluenz von 70-90 % erreichen lassen.
2. Die Kammern für den Invasionsassay vorbereiten und die Medien und Reagenzien auf die entsprechenden Temperaturen einstellen. Eine geeignete Menge Assaymedium vorbereiten, indem dem Endothelzellen-Basalmedium 10 % FBS hinzugefügt werden (z. B. 9 ml Basalmedium + 1 ml FBS). 750 μl Assaymedium in jedes Well und 500 μl Matrigel/EZM-Gel in den Zellkultureinsatz geben. Die 24-Well-Platte für 1-2 Stunden in einen befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) stellen.
3. Das Testmedium vorbereiten. Die Prüfsubstanz im Assaymedium lösen. Pro Well der 24-Well-Platte sollen 750 μl Testmedium eingesetzt werden. Wir empfehlen, ein zusätzliches Testmedium mit 20 ng/ml VEGF oder bFGF als Positivkontrolle herzustellen. Als Negativkontrolle kann ein Assaymedium ohne chemotaktischen Faktor verwendet werden.
4. Das Testmedium in die Wells geben. Die mit Matrigel/EZM-Gel beschichteten Einsätze mit einer Pinzette aus den Wells der 24-Well-Platte entnehmen und das Assaymedium aus jedem Well absaugen. Nach dem Zurücksetzen der Einsätze in die Wells 750 μl Testmedium in den Spalt zwischen Well und Einsatz pipettieren.
5. Die Endothelzellen ablösen. Die Endothelzellen sollten zu 70–90 % konfluent sein. Das Medium aus dem Kulturgefäß entnehmen und die Zellen durch Zugabe von 200 μl/cm² PBS (D8537) waschen. Die PBS entfernen und 100 μl/cm² Trypsin/EDTA (T3924) hinzufügen. Das Gefäß verschließen und die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen. Wenn sich die Zellen abzulösen beginnen, vorsichtig an die Seite des Gefäßes klopfen, um die restlichen Zellen zu lösen. Trypsinlösung durch Zugabe von 100 μl/cm² Trypsin-Neutralisationslösung (T6414) neutralisieren und das Kulturgefäß 30 Sekunden vorsichtig schütteln.
6. Die Zellen zählen. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen und das Röhrchen bei 220 x g 4 Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Assaymedium resuspendieren. Die Zellzahl nach den spezifischen Standardverfahren bestimmen.
7. Die Zellen in die mit Matrigel/EZM-Gel beschichteten Zellkultureinsätze aussäen. Die Zellkonzentration mit Assaymedium auf 1x10⁵ Zellen/ml verdünnen. Das Assaymedium aus den mit Matrigel beschichteten Einsätzen entnehmen, ohne die mit Matrigel beschichtete Oberfläche zu berühren. Vorsichtig 500 μl der Zellsuspension (= 5x10⁴ Zellen) in die Zellkultureinsätze geben.
8. Invasionsversuch starten. Die Zellen in den mit Matrigel beschichteten Einsätzen in einem befeuchteten Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) 16-28 Stunden inkubieren. Während der Inkubationszeit entwickelt sich ein Gradient der Prüfsubstanz über die Membran. Im Fall einer positiven Stimulation durch die Testsubstanz bauen die Zellen die Matrix ab, wandern durch die Poren am Gradienten entlang zur Unterseite der Membran und haften dort an.
9. Die nicht migrierten Zellen auf der Oberseite der Membran entfernen. Das Medium vorsichtig von allen mit Matrigel/EZM-Gel beschichteten Einsätzen entfernen. Danach die Einsätze mit einer Pinzette entnehmen und das Medium aus jedem Well absaugen. Nach dem erneuten Einsetzen der Einsätze in die Wells die nicht migrierten Zellen von der Oberseite der Membran mit einem Wattestäbchen entfernen. 750 μl PBS in den Spalt zwischen Well und Einsatz pipettieren.
10. Mit der Fixierung und Färbung der migrierten Zellen fortfahren.

Analyse der migrierten Zellen

Zellfixierung und Färbung
1. Die Membranen befestigen und die Einsätze trocknen. Die PBS vorsichtig aus den Wells entfernen und 750 μl kaltes Methanol (34860) (4 °C) in die Wells geben. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Methanol vorsichtig entfernen und 30 Minuten warten. Während dieser Zeit trocknet die Membran an der Luft. Nach dem Trocknen kann die Membran bei 4 °C gelagert und später verarbeitet werden.
2. Färben der Zellen. 750 μl Kristallviolett (V5265) in die Wells geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Die Membran waschen. Die Färbelösung vorsichtig entfernen und dreimal gründlich mit destilliertem Wasser waschen.
4. Mit der Analyse fortfahren.

Analyse

1. Visuelle Quantifizierung. 750 μl destilliertes Wasser in die Wells der 24-Well-Platte geben und die migrierten Zellen auf der unteren Seite der Membran unter einem Inversmikroskop zählen.
2. Kolorimetrische Quantifizierung mit einem Mikrotiterplatten-Analysegerät. 750 μl 10 % Essigsäure (A6283) in die Wells füllen und 30 Sekunden unter vorsichtigem Schütteln der 24-Well-Platte inkubieren. Die Zellen auf der Membran werden durch die Essigsäure lysiert und das Kristallviolett in den Zellen freigesetzt. Den Einsatz aus der 24-Well-Platte entnehmen und die optische Dichte der 10 % Essigsäure bei 595 nm mit einem Mikrotiterplatten-Analysegerät ablesen.

Ergebnisse

Abbildung 2. In-vitro-Zellmigration von Endothelzellen, stimuliert durch VEGF. Zellen, die ohne VEGF (links) und mit 20 ng/ml VEGF im Medium (rechts) durch die Membran migriert sind. Die Zellen sind mit Kristallviolett gefärbt.

Materialien

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Literatur

1. Van Hove AH, Benoit DSW. Depot-Based Delivery Systems for Pro-Angiogenic Peptides: A Review. Front. Bioeng. Biotechnol.. 3 https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00102

2. DeCicco-Skinner KL, Henry GH, Cataisson C, Tabib T, Gwilliam JC, Watson NJ, Bullwinkle EM, Falkenburg L, O'Neill RC, Morin A, et al. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. JoVE.(91): https://doi.org/10.3791/51312

3. Adams RH, Alitalo K. 2007. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(6):464-478. https://doi.org/10.1038/nrm2183

4. BOUIS D, KUSUMANTO Y, MEIJER C, MULDER N, HOSPERS G. 2006. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological Research. 53(2):89-103. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2005.10.006

5. Staton CA, Reed MWR, Brown NJ. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. 90(3):195-221. https://doi.org/10.1111/j.1365-2613.2008.00633.x

6. Kramer N, Walzl A, Unger C, Rosner M, Krupitza G, Hengstschläger M, Dolznig H. 2013. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752(1):10-24. https://doi.org/10.1016/j.mrrev.2012.08.001

7. Boyden S. 1962. THE CHEMOTACTIC EFFECT OF MIXTURES OF ANTIBODY AND ANTIGEN ON POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES. 115(3):453-466. https://doi.org/10.1084/jem.115.3.453

8. Chen H. 2005. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 29415-22.

9. Hulkower KI, Herber RL. Cell Migration and Invasion Assays as Tools for Drug Discovery. Pharmaceutics. 3(1):107-124. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics3010107

10. Poldervaart MT, Gremmels H, van Deventer K, Fledderus JO, Öner F, Verhaar MC, Dhert WJ, Alblas J. 2014. Prolonged presence of VEGF promotes vascularization in 3D bioprinted scaffolds with defined architecture. Journal of Controlled Release. 18458-66. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.007

11. Mori S, Tran V, Nishikawa K, Kaneda T, Hamada Y, Kawaguchi N, Fujita M, Takada YK, Matsuura N, Zhao M, et al. A Dominant-Negative FGF1 Mutant (the R50E Mutant) Suppresses Tumorigenesis and Angiogenesis. PLoS ONE. 8(2):e57927. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057927

12. Hussain S, Slevin M, Ahmed N, West D, Choudhary M, Naz H, Gaffney J. 2009. Stilbene glycosides are natural product inhibitors of FGF-2-induced angiogenesis. BMC Cell Biol. 10(1):30. https://doi.org/10.1186/1471-2121-10-30

13. Jia H, Bagherzadeh A, Bicknell R, Duchen MR, Liu D, Zachary I. 2004. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)-D and VEGF-A Differentially Regulate KDR-mediated Signaling and Biological Function in Vascular Endothelial Cells. J. Biol. Chem.. 279(34):36148-36157. https://doi.org/10.1074/jbc.m401538200

14. Grutzmacher C, Park S, Zhao Y, Morrison ME, Sheibani N, Sorenson CM. 2013. Aberrant production of extracellular matrix proteins and dysfunction in kidney endothelial cells with a short duration of diabetes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 304(1):F19-F30. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00036.2012

15. Bharadwaj AS, Appukuttan B, Wilmarth PA, Pan Y, Stempel AJ, Chipps TJ, Benedetti EE, Zamora DO, Choi D, David LL, et al. 2013. Role of the retinal vascular endothelial cell in ocular disease. Progress in Retinal and Eye Research. 32102-180. https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2012.08.004

16. Mierke CT. 2011. Cancer Cells Regulate Biomechanical Properties of Human Microvascular Endothelial Cells. J. Biol. Chem.. 286(46):40025-40037. https://doi.org/10.1074/jbc.m111.256172

17. Dorward HS, Du A, Bruhn MA, Wrin J, Pei JV, Evdokiou A, Price TJ, Yool AJ, Hardingham JE. 2016. Pharmacological blockade of aquaporin-1 water channel by AqB013 restricts migration and invasiveness of colon cancer cells and prevents endothelial tube formation in vitro. J Exp Clin Cancer Res. 35(1): https://doi.org/10.1186/s13046-016-0310-6