Comment fonctionnent les essais de ligature de proximité (PLA) ?

• Essai de ligature de proximité Duolink^®
  
• Détectez la dimérisation des récepteurs EGFR et HER2 avec l'essai de ligature de proximité Duolink^®
• Kit de contrôle Duolink^® PLA
• Formats de détection protéique des produits Duolink^® PLA
• Prise en main de la technologie Duolink^® PLA

Essai de ligature de proximité Duolink^®

L'essai de ligature de proximité (PLA pour "Proximity Ligation Assay") Duolink^® est un puissant outil qui permet de détecter des protéines endogènes, des modifications protéiques ou des interactions protéiques in situ, avec une spécificité et une sensibilité élevées. Les protéines cibles sont faciles à détecter et à localiser, avec une résolution à l'échelle de la molécule, dans les cellules et tissus non modifiés. En général, deux anticorps primaires produits chez différentes espèces sont utilisés pour détecter deux protéines cibles uniques (Figure 1A). Une paire d'anticorps secondaires marqués par des oligonucléotides (sondes PLA) se fixe alors aux anticorps primaires (Figure 1B). Ensuite, des oligonucléotides complémentaires relient les deux sondes PLA, uniquement si elles se trouvent à proximité l'une de l'autre, et une ligase forme une matrice d'ADN circulaire fermée, nécessaire à l'amplification par cercle roulant (RCA pour "Rolling-Circle Amplification") (Figure 1C). La sonde PLA sert alors d'amorce à une ADN polymérase qui synthétise des séquences concatémériques au cours de la RCA (Figure 1D). Cela donne un signal amplifié jusqu'à 1 000 fois qui reste attaché à la sonde PLA, permettant sa localisation. Enfin, des oligonucléotides marqués s'hybrident sur les séquences complémentaires de l'amplicon (Figure 1E), avant d'être visualisés et quantifiés sous forme de points lumineux (signaux PLA) par analyse d'images de microscopie (Figure 1F). L'essai de ligature de proximité Duolink^® peut être réalisé sur des cellules adhérentes, des préparations cytocentrifugées ou des coupes histologiques sur lame de verre, par immunofluorescence (c'est-à-dire détection dans le vert, le rouge, le rouge lointain ou l'orange) ou immunohistochimie (c'est-à-dire détection catalysée par la peroxydase). En outre, l'essai de ligature de proximité Duolink^® peut être réalisé sur du sang ou des cellules en suspension pour une détection par cytométrie en flux, et peut être utilisé sur des plaques multipuits (p. ex., au format 96 ou 384 puits) avec un système d'imagerie de criblage à haute densité pour une analyse à haut débit. Grâce à sa grande spécificité, à sa haute sensibilité et à sa polyvalence, l'essai de ligature de proximité Duolink^® est la technique de choix pour l'analyse des voies de signalisation, la cinétique de criblage des médicaments, la détermination de la CI50 et la validation des cibles.

Figure 1. Schéma d'une réaction d'essai de ligature de proximité Duolink^®. (A) Deux anticorps primaires reconnaissent spécifiquement une ou deux protéines d'intérêt dans la cellule. Les boules jaune et verte représentent deux épitopes d'une même protéine ou les épitopes de deux protéines différentes qui interagissent. (B) Des anticorps secondaires couplés à des oligonucléotides (sondes PLA) se fixent aux anticorps primaires. (C) Si les sondes PLA sont à proximité l'une de l'autre, des oligonucléotides "connecteurs" les relient et se ligaturent. (D) La matrice d'ADN circulaire fermée ainsi créée est amplifiée par une ADN polymérase. (E) Des oligonucléotides complémentaires couplés à un fluorochrome s'hybrident sur les séquences répétées des amplicons. (F) Les signaux PLA sont détectés par microscopie à fluorescence, où ils apparaissent sous forme de points lumineux, montrant la localisation intracellulaire de la protéine ou des interactions protéiques.

Détectez la dimérisation des récepteurs EGFR et HER2 avec l'essai de ligature de proximité Duolink^®

La dimérisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, ErbB1, HER1) et du récepteur épidermique humain 2 (HER2, ErbB2, Neu) est une interaction protéique bien connue. Les récepteurs EGFR et HER2 font partie de la famille des récepteurs à activité tyrosine kinase ErbB qui interviennent dans la régulation de la division et de la mort cellulaires. Les mutations qui modifient l'expression ou l'activité de l'une de ces deux protéines sont associées à la survenue de plusieurs cancers. La fixation d'un ligand (p. ex., facteur de croissance épidermique ou EGF pour "Epidermal Growth Factor") sur le domaine extracellulaire d'un récepteur EGFR entraîne l'activation du récepteur et l'autophosphorylation de sa queue cytoplasmique. Cela conduit à la formation d'homodimères (EGFR/EGFR) et d'hétérodimères (p. ex., EGFR/HER2) avec d'autres membres de la famille des ErbB (Figure 2). Cette dimérisation et la phosphorylation qui s'ensuit entraînent le recrutement de protéines adaptatrices et l'activation de voies de signalisation intracellulaires, et finissent par modifier la transcription des gènes, ce qui peut induire la prolifération ou l'invasion de cellules cancéreuses, une angiogenèse, la formation de métastases et une réduction de l'apoptose.

Figure 2. Schéma d'une dimérisation EGFR/HER2. Un ligand tel que le facteur de croissance épidermique (EGF) se fixe sur le domaine extracellulaire d'un récepteur EGFR, entraînant son activation et son autophosphorylation. Cela provoque à son tour une homodimérisation (non représentée) ou une hétérodimérisation du récepteur EGFR avec un autre membre de la famille des récepteurs ErbB, comme le récepteur HER2. La dimérisation et la phosphorylation qui s'ensuit entraînent l'activation des voies de signalisation en aval. Source de l'image : Lancet Oncol. 16(15): e543–e554

Assurez-vous que votre expérience fonctionne avec le kit de contrôle Duolink^® PLA – IPP

Les cellules de cancer ovarien humaines SK-OV3 expriment modérément à fortement les récepteurs EGFR et HER2. Le kit de contrôle Duolink^® PLA – IPP permet de confirmer la détection in situ d'une dimérisation EGFR/HER2 induite par l'EGF. Chaque kit contient deux lames compartimentées de 8 puits portant des cellules SKOV3 préfixées et traitées à l'EGF, ainsi que des anticorps primaires anti-EGFR de souris et anti-HER2 de lapin. Les concentrations optimales des anticorps primaires ont déjà été déterminées et les concentrations recommandées figurent sur la notice du produit. Après réhydratation dans du PBS concentré 1 ×, les cellules sont perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS concentré 1 × pendant 10 minutes à température ambiante, puis elles sont saturées pendant 1 heure à 37 °C avec le tampon de blocage Duolink^® PLA. Les cellules en puits dupliqués sont ensuite incubées avec les deux anticorps primaires. Les témoins techniques négatifs incluent une incubation avec chaque anticorps primaire séparé et avec aucun anticorps primaire, en puits dupliqués (Figure 3). Après lavage, un essai de ligature de proximité Duolink^® est réalisé selon le protocole Duolink^® PLA en fluorescence. Tous les puits sont incubés avec les sondes PLA PLUS anti-lapin Duolink^® et MINUS anti-souris Duolink®, et les signaux PLA sont générés avec le réactif de détection in situ Duolink^® rouge lointain. Le montage des lames est réalisé avec le milieu de montage Duolink^® in situ avec DAPI et les images sont acquises avec l'analyseur cellulaire GE IN 2200.

Figure 3. Configuration des lames du kit de contrôle Duolink^® PLA – IPP et emplacement des échantillons. Tous les puits contiennent des cellules SK-OV3 préfixées et stimulées à l'EGF. Après perméabilisation et blocage, les puits 1 et 5 sont incubés avec les anticorps primaires anti-EGFR de lapin et anti-HER2 de souris, les puits 2 et 6 avec l'anticorps anti-EGFR seul, les puits 3 et 7 avec l'anticorps anti-HER2 seul, et les puits 4 et 8 avec du diluant pour anticorps seul.

L'essai de ligature de proximité donne des résultats comparables lorsque les anticorps primaires sont incubés pendant 2 heures à 37 °C (Figures 4A à 4D) ou pendant une nuit à 4 °C (Figures 4E à 4H) ; l'utilisateur dispose ainsi d'une plus grande marge de manœuvre. Le signal PLA est détecté de manière très nette sur les cellules SK-OV3 stimulées à l'EGF en présence des deux anticorps primaires anti-EGFR et anti-HER2, révélant la présence de grandes quantités de complexes EGFR:HER2 (Figures 4A et 4E). Malgré un traitement uniforme des cellules SK-OV3 à l'EGF, le nombre de signaux PLA/complexes EGFR:HER2 varie selon les cellules. Cela peut s'expliquer par l'expression différentielle des récepteurs HER2 dans la population de cellules SK-OV3 (données non fournies). Inversement, peu de signaux PLA sont détectés en présence d'un seul anticorps primaire ou lorsque les deux anticorps primaires sont absents (Figures 4B à 4D et 4F à 4H). Il convient de signaler qu'une trop forte concentration en anticorps primaires peut augmenter le nombre de signaux PLA lorsque les anticorps sont utilisés séparément et/ou provoquer la coalescence des signaux PLA positifs, empêchant leur quantification précise (données non fournies). Il est donc important d'utiliser les concentrations d'anticorps primaires recommandées. Ces données consolidées démontrent que le kit de contrôle Duolink^® PLA – IPP permet de détecter et de quantifier les complexes EGFR:HER2 présents dans des cellules SK-OV3 stimulées à l'EGF.

Figure 4. Détection d'une dimérisation EGFR:HER2 induite par l'EGF avec l'essai de ligature de proximité Duolink^®. Des lames portant des cellules SK-OV3 fixées et traitées à l'EGF sont incubées avec les anticorps anti-EGFR de souris et anti-HER2 de lapin (A, E), l'anticorps anti-EGFR seul (B, F), l'anticorps anti-HER2 seul (C, G) ou du diluant pour anticorps seul (D, H) pendant 2 heures à 37 °C (A à D) ou pendant une nuit à 4 °C (E à H). Un essai de ligature de proximité Duolink^® est ensuite réalisé avec une sonde PLA PLUS anti-lapin et une sonde PLA MINUS anti-souris. Dix images aléatoires de chaque puits sont acquises avec un grossissement de 20 ×, avec les filtres DAPI (noyaux bleus) et Cy5 (signaux PLA rouges). Ces images sont représentatives d'au moins 5 expériences indépendantes.

Formats de détection protéique des produits Duolink^® PLA

Les produits pour essai de ligature de proximité Duolink^® PLA sont disponibles pour la fluorescence et pour le fond clair. Aujourd'hui, les réactifs Duolink^® PLA pour la fluorescence sont utilisés aussi bien dans les applications de microscopie que dans les applications de cytométrie en flux.

Détection en fluorescence

La microscopie à fluorescence est le format le plus utilisé pour les essais de ligature de proximité Duolink^®. Avec les réactifs Duolink^® PLA pour la fluorescence, le protocole est quasiment identique à celui de l'immunofluorescence classique, bien que la technologie des essais de ligature de proximité Duolink^® soit plus spécifique et plus polyvalente que l'immunofluorescence. L'étape d'amplification supplémentaire que prévoit l'essai de ligature de proximité Duolink^® accroît la sensibilité.

Détection en fond clair

Comme l'immunohistochimie classique, l'essai de ligature de proximité Duolink^® en fond clair s'utilise principalement sur des coupes histologiques fixées au formol et incluses en paraffine, mais il est également compatible avec d'autres types d'échantillons. Les réactifs de détection Duolink^® PLA pour le fond clair contiennent des oligonucléotides marqués à la peroxydase de raifort (HRP pour "Horseradish Peroxidase") qui, en présence d'un substrat spécifique, forme un précipité enzyme/substrat visible au microscope optique.

Cytométrie en flux

Le kit Duolink^® PLA pour la cytométrie en flux est un puissant outil d'analyse statistique. Il permet d'identifier la présence d'interactions protéine/protéine ou leur localisation cellulaire. Lorsqu'il est associé à la cytométrie en flux, l'essai de ligature de proximité Duolink^® permet de recueillir des données quantitatives à haut débit.

Prise en main de la technologie Duolink^® PLA

Le kit de démarrage Duolink^® PLA contient tous les réactifs nécessaires pour réaliser un essai de ligature de proximité Duolink^® et analyser jusqu'à 30 échantillons. Les seuls éléments à fournir sont les échantillons de tissus ou de cellules préparés, les anticorps primaires et le matériel de laboratoire usuel.

Un kit de démarrage Duolink^® PLA contient :

• Deux sondes PLA, une positive et une négative (PLUS et MINUS) (compatibles avec l'hôte des anticorps primaires)
• Du diluant pour anticorps et un tampon de blocage
• Un réactif de détection : rouge ou orange, au choix
• Un tampon d'amplification et de l'enzyme polymérase
• Une solution de ligature et de l'enzyme ligase
• Deux tampons de lavage, A et B
• Du milieu de montage avec DAPI

En plus des pages consacrées aux protocoles Duolink^® PLA pour la fluorescence, pour le fond clair et pour la cytométrie en flux, n'oubliez pas de visiter notre centre de ressources où vous trouverez des informations détaillées sur la mise en place et la bonne exécution d'un essai de ligature de proximité Duolink^®, notamment les pages suivantes :

• Comment optimiser l'essai Duolink® ?^® ?
• Résolution des problèmes et questions fréquentes
• Vidéo pédagogique sur l'essai de ligature de proximité Duolink^®