Protocole Duolink^® PLA en fluorescence

Ce protocole décrit l'utilisation des réactifs Duolink^® PLA pour la détection, la visualisation et la quantification par immunofluorescence de protéines, de modifications protéiques et d'interactions protéiques dans des échantillons cellulaires et tissulaires. Pour mieux connaître la technologie Duolink^® PLA, nous vous invitons à télécharger notre brochure et à consulter la page How to Optimize the Duolink^® Proximity Ligation Assay (Comment optimiser l'essai de ligature de proximité Duolink^® ?) pour plus de détails. Pour les autres protocoles, veuillez consulter la page Protocole Duolink^® PLA en fond clair et le document Duolink^® PLA Probemaker Guide.

Matériel et équipement
Protocole Duolink^® PLA en fluorescence
Résultats
Résolution des problèmes
Références

Matériel et équipement

Réactifs Duolink^® PLA

Veuillez consulter le guide de sélection des produits Duolink^® PLA pour obtenir des conseils spécifiques sur ces produits. En bref, pour réaliser un essai de ligature de proximité Duolink^® en vue d'une détection par fluorescence, vous avez besoin des produits Duolink^® PLA suivants :

1. Sondes PLA Duolink^® (une positive et une négative, de différentes espèces, compatibles avec l'espèce hôte de vos anticorps primaires). Contenu du kit :
   1. Sondes PLA, 5 × (positives et/ou négatives, selon le produit)
   2. Solution de blocage (pour bloquer l'échantillon avant son incubation avec les anticorps)
   3. Diluant pour anticorps (pour diluer les sondes PLA, et si nécessaire, les anticorps primaires)
   ATTENTION : Tous les composants du kit doivent être conservés à 4 °C.

   Remarque : Les kits Duolink^® PLA Probemaker PLUS et/ou Probemaker MOINS peuvent être utilisés pour produire des sondes PLA sur mesure, si nécessaire. Consulter le document "Probemaker Guide" pour en savoir plus.

2. Réactif de détection par fluorescence Duolink^® (vert, orange, rouge ou rouge lointain, au choix). Contenu du kit :
   1. Solution de ligature (concentrée 5 ×) (diluée pour former le tampon de ligature concentré 1 ×)
   2. Ligase (1 U/μl) (ajoutée pour former la solution de ligature)
   3. Solution d'amplification (concentrée 5 ×) (diluée pour former le tampon d'amplification concentré 1 ×)
   4. Polymérase (10 U/μl) (ajoutée pour former la solution d'amplification)
   ATTENTION : Tous les composants doivent être conservés à -20 °C.
3. Tampons de lavage pour la fluorescence (A et B)
4. Milieu de montage Duolink^® avec DAPI (pour une utilisation sur lames, à conserver entre 2 °C et 8 °C) OU colorant nucléaire et agent anti-décoloration (pour utilisation sur microplaques, à conserver à -20 °C)

Matériel supplémentaire

1. Anticorps primaires choisis pour la détection de la ou des protéines d'intérêt. Ils doivent avoir été produits chez la souris, le lapin ou la chèvre pour pouvoir être utilisés avec les sondes PLA Duolink^®.
2. Eau ultrapure (stérilisée par filtration, Milli-Q^® ou analogue)
3. Échantillon (cellules ou tissus) sur lame, prétraité pour la fixation, le démasquage et la perméabilisation. Consulter la page "How to Optimize the Duolink^® Proximity Ligation Assay" pour obtenir des suggestions et des recommandations, ainsi que des informations détaillées sur les points suivants :
   1. Conception expérimentale et témoins
   2. Choix des anticorps primaires et optimisation
   3. Traitement de l'échantillon

Équipement

1. Microscope à fluorescence équipé de filtres appropriés, d'un appareil photo et d'un logiciel d'acquisition d'images
2. Incubateur à 37 °C
3. Agitateur orbital
4. Étuve humide chauffée ou bloc conducteur de chaleur pour microplaques
5. Marqueur hydrophobe pour délimiter la zone de détection
6. Bloc de congélation (pour les enzymes)
7. Cuves à coloration
8. Pince
9. Pipettes et pointes de pipettes (de 1 μl à 1 000 μl)
10. Lamelles couvre-objets compatibles avec la microscopie à fluorescence

Protocole Duolink^® PLA en fluorescence

Le protocole décrit ci-dessous s'applique à un échantillon de 1 cm² sur lame, nécessitant 40 µl de solution pour être correctement couvert. Le volume doit être ajusté en fonction de la zone de détection et du nombre d'échantillons. Toutes les incubations doivent être réalisées en étuve humide. Toutes les étapes de lavage doivent être réalisées à température ambiante, dans une cuve à coloration contenant au moins 70 ml de tampon, sous agitation modérée.

Préparation des réactifs

1. Les tampons de lavage A et B doivent être préparés avant le début de l'essai, en dissolvant le contenu d'une poche dans de l'eau ultrapure de façon à obtenir un volume final de 1 000 ml. Les solutions peuvent être maintenues à température ambiante pour une conservation à court terme (moins de deux semaines) ou à 4 °C pour une conservation à long terme. ATTENTION : Amener les solutions à température ambiante avant utilisation.
2. Le tampon de lavage B concentré 0,01 × doit être préparé avant le début de l'essai, en diluant le tampon de lavage B concentré 1 × au 1/100e dans de l'eau ultrapure.
3. Beaucoup de réactifs Duolink^® PLA sont fournis sous forme de solutions concentrées et doivent être dilués juste avant utilisation. Les réactifs Duolink^® PLA dilués ne se conservent pas.

Protocole Duolink^® PLA

Avant de commencer, les échantillons doivent être déposés sur des lames de verre et prétraités pour la fixation, le démasquage et/ou la perméabilisation. Consulter la page "How to Optimize the Duolink^® Proximity Ligation Assay" pour en savoir plus.

1. Blocage
   1. Mélanger la solution de blocage Duolink^® au vortex.
   2. Déposer 1 goutte (~40 µl) de solution de blocage Duolink^® sur chaque échantillon de 1 cm². Veiller à bien couvrir tout l'échantillon.
   3. Incuber les lames dans une étuve humide pendant 60 minutes à 37 °C.
2. Incubation des anticorps primaires ATTENTION : Ne pas laisser la lame sécher avant l'ajout des anticorps, au risque de créer du bruit de fond.
   1. Mélanger le diluant pour anticorps Duolink^® au vortex.
   2. Diluer le ou les anticorps primaires à une concentration appropriée dans le diluant pour anticorps Duolink^®.
   3. Éliminer la solution de blocage Duolink^® en tapotant les lames.
   4. Déposer la solution d'anticorps primaires sur chaque échantillon.
   5. Incuber les lames dans une étuve humide. Utiliser la température et la durée d'incubation optimales pour vos anticorps primaires.
3. Incubation des sondes PLA Duolink^®
   
   1. Mélanger les sondes PLA positive et négative au vortex.
   2. Diluer les sondes PLA positive et négative au 1/5e dans le diluant pour anticorps Duolink^®.
      Pour un volume réactionnel de 40 µl, prendre 8 µl de solution de sonde PLA négative, 8 µl de solution de sonde PLA positive et 24 µl de diluant pour anticorps. Préparer suffisamment de solution pour tous les échantillons.
   3. Éliminer la solution d'anticorps primaire en tapotant les lames.
   4. Laver les lames 2 × 5 minutes dans le tampon de lavage A concentré 1 x à température ambiante.
   5. Éliminer le surplus de tampon de lavage en tapotant les lames et appliquer la solution de sondes PLA.
   6. Incuber les lames dans une étuve humide préchauffée, pendant 1 heure à 37 °C.
4. Ligature
   ATTENTION : Attendre le dernier moment pour ajouter la ligase (juste avant l'ajout de l'échantillon). S'assurer que le tampon de ligature est complètement décongelé et bien mélangé avant utilisation.
   1. Diluer le tampon de ligature Duolink^® concentré 5 × au 1/5e dans de l'eau ultrapure et mélanger.
      Pour un volume réactionnel de 40 µl, ajouter 8 µl de tampon de ligature concentré 5 × à 32 µl d'eau ultrapure. Préparer suffisamment de solution pour tous les échantillons.
   2. Éliminer la solution de sonde PLA en tapotant les lames.
   3. Laver les lames 2 × 5 minutes dans le tampon de lavage A concentré 1 x à température ambiante.
   4. Pendant le lavage, sortir la ligase du congélateur en utilisant un bloc de congélation (-20 °C).
   5. Ajouter la ligase au tampon de ligature concentré 1 × de l'étape a, à une dilution au 1/40e, et mélanger.
      Pour 40 µl de solution de ligature, ajouter 1 µl de ligase à 39 µl de tampon de ligature concentré 1 ×.
   6. Éliminer le surplus de tampon de lavage en tapotant les lames et appliquer la solution de ligature.
   7. Incuber les lames dans une étuve humide préchauffée, pendant 30 minutes à 37 °C.
5. Amplification
   ATTENTION : Attendre le dernier moment pour ajouter la polymérase (juste avant l'ajout de l'échantillon). Le tampon d'amplification est photosensible. Toutes les solutions qui en contiennent doivent être protégées de la lumière.
   1. Diluer le tampon d'amplification concentré 5 × au 1/5e dans de l'eau ultrapure et mélanger. Pour un volume réactionnel de 40 µl, ajouter 8 µl de tampon d'amplification concentré 5 × à 32 µl d'eau ultrapure. Préparer suffisamment de solution pour tous les échantillons.
   2. Éliminer la solution de ligature en tapotant les lames.
   3. Laver les lames 2 × 5 minutes dans le tampon de lavage A concentré 1 x à température ambiante.
   4. Pendant le lavage, sortir la polymérase du congélateur en utilisant un bloc de congélation (-20 °C).
   5. Ajouter la polymérase au tampon d'amplification concentré 1 × de l'étape a, à une dilution au 1/80e, et mélanger.
   6. Éliminer le surplus de tampon de lavage en tapotant les lames et appliquer la solution d'amplification.
   7. Incuber les lames dans une étuve humide préchauffée, pendant 100 minutes à 37 °C.
6. Lavages finaux
   ATTENTION : Réactifs photosensibles. Toujours maintenir les lames à l'abri de la lumière.
   1. Éliminer la solution d'amplification en tapotant les lames.
   2. Laver les lames 2 × 10 minutes dans le tampon de lavage B concentré 1 x à température ambiante.
   3. Laver les lames pendant 1 minute dans le tampon de lavage B concentré 0,01 ×.
7. Préparation à l'acquisition d'images
   ATTENTION : Le milieu de montage Duolink^® in situ avec DAPI est aqueux et ne se solidifie pas. Du vernis à ongles transparent peut être utilisé pour "luter" la lamelle couvre-objet sur la lame. Éviter de piéger des bulles d'air sous la lamelle couvre-objet.
   1. Éliminer le surplus de tampon de lavage en tapotant les lames.
   2. Monter une lamelle couvre-objet sur chaque lame en utilisant un volume minimal de milieu de montage Duolink^® in situ avec DAPI.
   3. Attendre 15 minutes avant d'observer les lames au microscope à fluorescence ou au microscope confocal, avec un grossissement minimal de 20 ×.
   4. Une fois les images acquises, les lames se conservent à 4 °C pendant 4 jours ou à -20 °C pendant 6 mois, à l'abri de la lumière.

Résultats

Acquisition d'images

Le résultat d'un essai de ligature de proximité Duolink^® est généralement observé à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé de filtres adaptés à la détection du fluorochrome utilisé. Le signal PLA Duolink^® se caractérise par la formation de points lumineux discrets en différents endroits des cellules étudiées (figure 1A). Chaque signal est submicrométrique et peut se situer dans différents plans focaux. Il peut donc être nécessaire de prendre des clichés dans toute l'épaisseur de l'échantillon. Il est toutefois possible de prendre les clichés dans un seul plan tant que toutes les images à comparer sont acquises en une même position de l'échantillon. On notera qu'il n'est pas rare de détecter quelques signaux sur les témoins techniques négatifs (p. ex. sans anticorps primaires, figure 1B). En revanche, un nouveau titrage de l'anticorps primaire pourra s'avérer nécessaire en présence de plus d'un ou deux signaux pour dix cellules.

Figure 1. Détection du récepteur EGFR dans des préparations de cellules A431 cytocentrifugées avec l'essai de ligature de proximité Duolink®. Les images montrent une projection de l'intensité maximale de l'image brute basée sur 20 plans z. Les signaux PLA apparaissent en rouge et les noyaux en bleu. L'image des noyaux a été prise dans un seul plan z. A) Réaction positive. B) Témoin négatif sans anticorps primaires.

Il est important d'utiliser les mêmes paramètres (temps de pose, gain, filtres utilisés, etc.) pour capturer toutes les images au cours d'une expérience. Ces paramètres peuvent être optimisés avec des témoins positifs et négatifs. Si le nombre de signaux PLA est élevé, ceux-ci peuvent fusionner/entrer en coalescence (figure 2). Ce phénomène peut se produire lors de l'étude de protéines fortement exprimées ou en raison d'une surexposition au moment de la prise du cliché. Il faut donc veiller à régler les paramètres d'acquisition de façon à obtenir des signaux PLA bien distincts. Consulter le guide de dépannage Duolink^® PLA pour savoir comment éviter la coalescence des signaux et découvrir d'autres possibilités d'optimisation.

Figure 2. Détection du récepteur Her2 dans des préparations de cellules à forte expression SKBR-3 fixées au formol et incluses en paraffine avec l'essai de ligature de proximité Duolink®. Les images montrent une projection de l'intensité maximale de l'image brute basée sur 20 plans z. Les signaux PLA apparaissent en rouge et les noyaux en bleu. L'image des noyaux a été prise dans un seul plan z. A) Réaction positive. B) Témoin négatif sans anticorps primaires.

Analyse des images

Plusieurs outils d'analyse d'images peuvent être utilisés pour quantifier les signaux PLA. Les données des images peuvent être analysées pour déterminer l'intensité moyenne de fluorescence des signaux PLA et/ou le nombre total de signaux PLA par cellule ou par zone de la cellule (figure 3). Ces données quantitatives sont ensuite exprimées en pourcentage par rapport à des témoins techniques et/ou biologiques propres à l'expérience menée. La fiabilité de la quantification est toutefois conditionnée à l'absence de coalescence des signaux PLA et à la non-saturation des pixels des images.

Figure 3. Analyse d'images avec un logiciel d'imagerie. Les noyaux colorés au DAPI (bleu) ont été détectés automatiquement et la taille du cytoplasme a été estimée par l'utilisateur (contours verts). Les signaux PLA apparaissent en rouge, représentant la protéine cible d'intérêt. Les signaux PLA entourés d'un cercle blanc et les noyaux cerclés de jaune ont été quantifiés pendant l'analyse.

Résolution des problèmes

Le guide de dépannage Duolink^® PLA contient des conseils pratiques, des recommandations générales sur la résolution des problèmes et une foire aux questions (FAQ).

N'hésitez pas à contacter notre assistance technique pour obtenir de l'aide dans le cadre de vos expériences. Vous pouvez aussi contacter votre représentant commercial local.

Services sur mesure

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Références

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473