Concentration de virus par ultrafiltration

• Isolement, propagation et caractérisation des virus
• Méthode générale de propagation virale
• Concentration de virus pour la constitution de stocks de virus de titre élevé
• Concentration de virus avec les dispositifs d'ultrafiltration Amicon^® Ultra
• Conclusions
• Dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation

Isolement, propagation et caractérisation des virus

Figure 1. Ultrafiltration pour la concentration de virus. Le fluide traverse le filtre membrane, tandis que les grosses particules virales sont retenues.

Les méthodes d'isolement et de propagation des virus sont essentielles aux travaux de recherche, de production de vaccins et de diagnostic. Les laboratoires de recherche fondamentale utilisent des stocks de virus pour étudier la biologie virale et la pathogenèse. La production de vaccins requiert une préparation de virus à petite échelle et à grande échelle. Et, même si la plupart des laboratoires de diagnostic utilisent désormais des approches sans culture pour le diagnostic des maladies virales, l'isolement de virus en culture cellulaire reste une approche utile lorsqu'on a besoin d'isolats viables, lorsque des virus viables et non viables doivent être différenciés, et dans les cas où les méthodes impliquant une culture sont capables de donner des résultats plus rapides que les méthodes sans.

Il est possible de propager les virus dans une culture cellulaire pour générer des stocks de virus. Les cellules cultivées sont inoculées avec un stock de virus issu d'une souche virale, d'une source commerciale ou d'un tissu infecté. Après incubation, les cellules infectées sont lysées afin de récolter les particules virales, ou bien le virus libéré est directement récolté à partir du surnageant des cellules. Le stock de virus est ensuite titré, divisé en aliquotes et conservé à −80 °C pour un usage ultérieur.

L'isolement de virus à partir d'échantillons cliniques repose également sur la culture cellulaire pour assurer la propagation virale. Les échantillons cliniques sont préparés par homogénéisation des échantillons et extraction dans un milieu liquide, qui est ensuite centrifugé et employé pour inoculer les cultures de cellules.

Afin d'obtenir des stocks de virus de titre élevé, il est nécessaire de concentrer les particules virales purifiées. Les dispositifs à centrifuger Amicon^® Ultra et Centricon^® Plus avec membranes en cellulose régénérée peuvent être utilisés pour concentrer les virions et les virus en solution (Figure 1). Ce protocole décrit l'utilisation des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation Amicon^® et Centricon^® pour concentrer trois types de virus courants : un lentivirus, un adénovirus et un virus adéno-associé (AAV).

Méthode générale de propagation virale

1. Cellules d'encapsidation : les cellules hôtes ont été mises en culture jusqu'à atteindre une confluence de 80–85 %.
2. Transfection : les cellules ont été infectées par des particules virales viables.
3. Récolte du virus : selon le virus, le surnageant de cellules et/ou les amas de cellules ont servi à purifier les virions recombinants. Quatre cycles de congélation/décongélation ont été appliqués afin de faire sortir le virus des cellules. Les débris cellulaires ont ensuite été séparés du lysat cellulaire par centrifugation. 
   
4. Purification du virus : le virus a été purifié à partir du lysat cellulaire par ultracentrifugation à gradient de densité ou chromatographie sur colonne/membrane.
5. Les solutions virales purifiées ont été concentrées et leur tampon échangé par dialyse passive, diafiltration ou ultrafiltration par centrifugation avec des dispositifs Amicon^® Ultra et Centricon^® Plus 70 afin d'obtenir une solution de conservation adaptée.

Concentration de virus pour la constitution de stocks de virus de titre élevé

Pour produire des stocks viraux de titre élevé, il est possible de concentrer le virus purifié en utilisant l'ultrafiltration par centrifugation. Il est crucial de bien choisir le dispositif, le matériau constituant la membrane, le seuil de coupure ou le poids moléculaire limite, la vitesse de centrifugation, la durée de centrifugation et la composition du tampon pour assurer une récupération élevée des particules virales infectieuses. Les unités d'ultrafiltration par centrifugation Amicon^® Ultra possèdent des poids moléculaires nominaux limites (PMNL ou NMWL) définis par la membrane. Des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation Amicon^® Ultra équipés d'une membrane Ultracel^® d'un PMNL de 50 kDa ont été utilisés pour concentrer les solutions d'adénovirus et de virus adéno-associé (AAV). La concentration du lentivirus a été réalisée avec des dispositifs munis de membranes d'un PMNL de 50 kDa et 100 kDa.

Facteurs à prendre en compte lors de la sélection d'une méthode d'ultrafiltration et du seuil de coupure nominal de la membrane :

1. Taille des particules virales : la taille peut être estimée à partir de publications, ou par des techniques de mesure telles que la microscopie, la diffraction laser ou la diffusion dynamique de la lumière.
2. Taille des principaux composés à séparer dans la solution : la taille des protéines, anticorps, médicaments, composés chimiques et autres particules qui doivent être séparés affecte le choix de la taille de la membrane.
3. Volume de l'échantillon : les dispositifs d'ultrafiltration (cUF) peuvent traiter des volumes allant de ≤ 0,5 ml à 70 ml.

Pour retenir des particules virales, le seuil de coupure de la membrane filtrante doit être inférieur à la taille de la particule (env 2 fois plus petit que le poids moléculaire de la particule virale), mais suffisamment grand pour laisser passer les éléments plus petits (Tableau 1).

Tableau 1. Choix du MWCO de la membrane d'ultrafiltration d'après la taille des particules virales.

MWCO (kDa) de la membrane d'ultrafiltration	Dimension nominale des pores (nm)	Plage de tailles nominales retenues recommandée pour l'ultrafiltration
		Diamètre (nm)		Poids moléculaire (kDa)
		Minimum	Maximum	Minimum	Maximum
3	0,3	1	1,5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Concentration de virus avec les dispositifs d'ultrafiltration Amicon^® Ultra

Le Tableau 2 montre les résultats de la concentration de l'adénovirus, du lentivirus et de l'AAV à partir du lysat cellulaire brut et du virus purifié par chromatographie. Les particules virales ont été concentrées efficacement jusqu'à atteindre des titres élevés avec de fortes récupérations à l'aide de dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation Amicon^® Ultra.

Tableau 2. Concentration de virus avec des dispositifs d'ultrafiltration. Nous ne recommandons pas de concentrer les virus à plus de 10¹³ particules/ml en raison du risque d'agrégation virale.

Échantillon de départ	Dispositif	Titre viral de départ	Volume de départ (ml)	Facteur de concentration	Temps de centrifugation à 1500 x g (min)	Récupération (%)
Adénovirus dans un lysat cellulaire brut	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	1 × 108	4	27×	20	> 100
Adénovirus purifié, dans un tampon salin 1 M	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	1 × 108	4	45×	10	85
AAV dans un lysat cellulaire brut	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	2 × 107	4	20×	35	50
AAV dans un lysat cellulaire brut	Amicon® Ultra-15, 50 kDa	2 × 107	10	25×	45	76
AAV dilué dans un tampon constitué de Tris 100 mM et de NaCl 250 mM	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	5 × 106	4	20×	20	100
Lentivirus dans un surnageant de culture cellulaire	Amicon® Ultra-4, 100 kDa	9 × 104	4	100×	30	> 100
Lentivirus dans un surnageant de culture cellulaire	Amicon® Ultra-4, 50 kDa	9 × 104	4	100×	30	93
Lentivirus dans un surnageant de culture cellulaire	Centricon Plus-70, 100 kDa	8 × 103	65	80×	30	81

Il est important de garder à l'esprit que la plupart des virus ne peuvent pas être concentrés efficacement et conservés dans une solution tampon de faible concentration en sels. Concentrer par centrifugation les virus dans une solution saline de concentration inférieure à 250 mM provoque leur agrégation et diminue leur infectivité.

Le stock viral concentré peut être filtré avec un filtre de 0,22 µm. Il est possible d'employer des unités de filtration Ultrafree^®-MC GV pour les volumes < 0,5 ml.

Conclusions

Nous avons développé une méthode pour valider l'ultrafiltration avec les dispositifs à centrifuger Amicon^® Ultra et Centricon^® Plus qui permet d'atteindre des titres élevés de virus de manière rapide et rentable. Cette méthode peut servir à concentrer les virus à partir de surnageants de culture cellulaire, de lysats cellulaires et d'autres sources. Après concentration, le stock de virus peut être stérilisé par filtration avec des unités de filtration Ultrafree^®. Pour une récupération maximale des particules virales infectieuses, il est crucial de bien choisir le dispositif d'ultrafiltration, le filtre membrane, le seuil de coupure (MWCO), la vitesse de centrifugation et la durée de centrifugation.

Dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation

Poids moléculaire nominal limite, PMNL, du dispositif (kDa)	Dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation Amicon® Ultra				Dispositifs à centrifuger Centricon® Plus 70
	0,5 ml	2 ml	4 ml	15 ml	15 – 70 ml
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* Produit homologué pour un usage en diagnostic in vitro (IVD)