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  • Evaluation of the sensitivity, responsiveness and reproducibility of primary rainbow trout hepatocyte vitellogenin expression as a screening assay for estrogen mimics.

Evaluation of the sensitivity, responsiveness and reproducibility of primary rainbow trout hepatocyte vitellogenin expression as a screening assay for estrogen mimics.

Aquatic toxicology (Amsterdam, Netherlands) (2015-01-07)
Maria T Hultman, Jan Thomas Rundberget, Knut Erik Tollefsen
RÉSUMÉ

Vitellogenin (Vtg) induction in primary fish hepatocytes has been proposed as an in vitro screening assay for ER agonists and antagonists, but has not yet been used extensively as a high-throughput screening tool due to poor reproducibility, sensitivity and overall feasibility. The present work has evaluated the role of seasonal variation, normalization, optimal culture and assay conditions on the sensitivity, responsiveness and reproducibility of in vitro vtg gene mRNA and protein expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) primary hepatocytes using the xenoestrogen 17α-ethynylestradiol (EE2) as a test chemical. The results show that primary hepatocytes display a relatively high individual and seasonal variation in both Vtg mRNA and protein induction potential, although less variance was observed in assay sensitivity. Data normalization of assay response to maximum (3 nM EE2) and minimum (DMSO) Vtg production dramatically reduced this variance and led to improved assay reproducibility. A time-dependent response was observed both for mRNA and protein expression, reaching maximum Vtg induction after 96 h of exposure, although reproducible concentration response curves for both Vtg mRNA and protein could be obtained already after 48 h. A need for chemical re-exposure of the hepatocytes was identified to be important for sustaining exposure concentrations in extended studies (>48 h), whereas different plate formats (96, 24 or 6 wells) did not affect the bioassay performance. In conclusion, standardization of hepatocyte bioassay and test conditions as well as data-normalization procedures are proposed to be instrumental for more consistent and comparable results in future use of this in vitro assay.

MATÉRIAUX
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Sigma-Aldrich
Méthanol, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acétone, ACS reagent, ≥99.5%
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Méthanol, ACS reagent, ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Acétone, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Méthanol, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acétone, HPLC Plus, for HPLC, GC, and residue analysis, ≥99.9%
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Toluène, ACS reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Bicarbonate de sodium, ACS reagent, ≥99.7%
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Méthanol, HPLC Plus, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Carbonate de sodium, powder, ≥99.5%, ACS reagent
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Sigma-Aldrich
Toluène, suitable for HPLC, 99.9%
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Sigma-Aldrich
Toluène, HPLC Plus, for HPLC, GC, and residue analysis, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Bicarbonate de sodium, powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
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Sigma-Aldrich
Acétone, Laboratory Reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Acétate d′ammonium, ACS reagent, ≥97%
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Sigma-Aldrich
Carbonate de sodium, ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder or granules
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Sigma-Aldrich
Bicarbonate de sodium, ReagentPlus®, ≥99.5%, powder
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Sigma-Aldrich
Acétate d′ammonium, ≥99.99% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Copper(II) sulfate, ReagentPlus®, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Méthanol, suitable for HPLC, gradient grade, suitable as ACS-grade LC reagent, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Méthanol, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.8% (GC)
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Sigma-Aldrich
Toluène, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.7% (GC)
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Sigma-Aldrich
Acétone, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
Carbonate de sodium, ACS reagent (primary standard), anhydrous, 99.95-100.05% dry basis
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Sigma-Aldrich
Méthanol, Laboratory Reagent, ≥99.6%
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Sigma-Aldrich
Dansyl chloride, BioReagent, suitable for amino acid labeling, powder and chunks, ≥99% (HPLC)
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Quantité
Sigma-Aldrich
Bicarbonate de sodium, anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ACS reagent, ≥99.7%
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Quantité
Sigma-Aldrich
Carbonate de sodium, ReagentPlus®, ≥99.5%
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Quantité
Sigma-Aldrich
Acétone, suitable for HPLC, ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Acétate d′ammonium, for molecular biology, ≥98%
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