Concentração de vírus por Ultrafiltração

• Isolamento, propagação e caraterização de vírus
• Métodos gerais de propagação viral
• Concentração de vírus para estoques de vírus de alta titulação
• Concentração de vírus com dispositivos Amicon^® Ultra Centrifugal Ultrafiltration
• Conclusões
• Dispositivos de ultrafiltração centrífuga

Isolamento, propagação e caraterização de vírus

Figura 1. Ultrafiltração para concentração de vírus. O fluido passa através do filtro de membrana, enquanto grandes partículas virais são retidas.

Os métodos de isolamento e propagação de vírus são fundamentais na pesquisa, produção de vacinas e fluxos de trabalho de diagnóstico. Laboratórios de pesquisa básica usam estoques virais para estudar biologia viral e patogênese. A produção de vacinas requer preparação de vírus em pequena e grande escala. E embora a maioria dos laboratórios de diagnóstico agora use abordagens não culturais para o diagnóstico de doenças virais, o isolamento do vírus na cultura celular continua sendo uma abordagem útil quando isolados viáveis são necessários, quando vírus viável e inviável deve ser diferenciado e nos casos em que métodos baseados em cultura são capazes de fornecer resultados mais rápidos do que os métodos não culturais.

Os vírus podem ser propagados na cultura celular para gerar estoques de vírus. As células cultivadas são inoculadas com o estoque viral do vírus da semente, uma fonte comercial, ou tecido infetado. Após a incubação, as células infetadas são lisadas para colher partículas virais, ou o vírus liberado é colhido diretamente dos sobrenadantes celulares. O estoque de vírus é então titulado, dividido em alíquotas e armazenado a -80°C para uso posterior.

O isolamento de vírus de amostras clínicas também explora a cultura celular para propagação viral. As amostras clínicas são preparadas por homogeneização e extração de amostras em um meio líquido, que é então centrifugado e usado para inocular culturas celulares.

Para conseguir estoques de vírus de alta titulação, é necessário concentrar partículas de vírus purificadas. Os dispositivos Amicon^® Ultra e Centricon^® Plus centrifugal ultrafiltration com membranas de celulose regenerada podem ser usados para concentrar vírions e soluções de vírus (Figura 1). Este protocolo descreve a utilização de dispositivos Amicon^® e Centricon^® centrifugal ultrafiltration para a concentração de três tipos comuns de vírus: Lentivírus, adenovírus e vírus adenoassociado (AAV).

Método geral de propagação viral

1. Células de empacotamento: As células hospedeiras foram plaqueadas para atingir 80-85% de confluência.
2. Transfecção: As células foram infectadas com partículas virais viáveis.
3. Coleta vírus: Dependendo do vírus, células sobrenadantes ou peletizadas de células, ou ambas, foram usadas para purificar os vírions recombinantes. Quatro rodadas de ciclos de congelamento/descongelamento foram aplicadas para liberar vírus das células. Os detritos celulares foram então separados do lisado celular por centrifugação. 
   
4. Purificação do vírus: O vírus foi purificado a partir do lisado celular por ultracentrifugação do gradiente de densidade ou cromatografia de coluna/membrana.
5. As soluções de vírus purificados foram concentradas e o tampão foi trocado em uma solução de armazenamento apropriada usando diálise passiva, diafiltração ou ultrafiltração centrífuga com dispositivos Amicon^® Ultra e Centricon^® Plus 70.

Concentração de vírus para estoques de vírus de alta titulação

Para produzir estoques virais de alta titulação, o vírus purificado pode ser concentrado usando ultrafiltração centrífuga. A escolha correta do dispositivo, do material da membrana, do limite de peso molecular ou do corte, da velocidade de centrifugação, do tempo de centrifugação e da composição do tampão são fundamentais para a recuperação elevada de partículas virais infecciosas. As unidades Amicon^® Ultra centrifugal especificaram limites de peso molecular nominal (NMWL) definidos pela sua membrana filtrante. Foram utilizados dispositivos Amicon^® Ultra centrifugal ultrafiltration com um 50 kDa NMWL Ultracel^®para concentrar soluções de adenovírus e vírus adenoassociado (AAV). Para a concentração de lentivírus, foram utilizados dispositivos com membranas NMWL de 50 kDa e 100 kDa.

Fatores a considerar ao selecionar um método de ultrafiltração e tamanho de peso molecular nominal da membrana:

1. Tamanho de partícula viral: O tamanho pode ser estimado a partir de fontes publicadas, ou por técnicas de medição, como microscopia, difração a laser e dispersão de luz dinâmica.
2. Tamanho dos alvos de separação chave na solução: O tamanho de proteínas, anticorpos, drogas, produtos químicos e outras partículas que precisam ser separadas afetará a seleção do tamanho da membrana.
3. Volume da amostra: Volumes de processamento que variam de ≤0,5 mL a 70 mL são compatíveis com dispositivos de ultrafiltração centrífuga (CUF).

Para reter partículas virais, o corte de peso molecular da membrana do filtro precisa ser menor que a partícula (cerca de 2 vezes menor que o peso molecular da partícula viral), mas grande o suficiente para permitir que componentes menores sejam filtrados
(Tabela 1).

Tabela 1. Seleção de membrana de ultrafiltração NMWL baseada no tamanho de partícula viral.

Membrana de ultrafiltração NMWL (kDa)	Tamanho nominal dos poros (nm)	Faixa de tamanho de retenção nominal de ultrafiltração recomendada
		Diâmetro (nm)		Peso molecular (kDa)
		Mínimo	Máximo	Mínimo	Máximo
3	0,3	1	1,5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Concentração de vírus com dispositivos Amicon^® Ultra Centrifugal Ultrafiltration

ATabela 2 mostra os resultados da concentração de adenovírus, lentivírus e AAV tanto do lisado de células brutas quanto do vírus purificado por cromatografia. As partículas virais foram efetivamente concentradas em altos títulos com altas recuperações dispositivos Amicon^® Ultra centrifugal ultrafiltration.

Tabela 2. Concentração de vírus usando dispositivos de ultrafiltração. Não recomendamos concentrar o vírus em mais de 1013 partículas/mL devido à potencial agregação de vírus.

Amostra inicial	Dispositivo	Titulação viral inicial	Volume (mL) inicial	Fator de concentração	Tempo de rotação a 1500 x g (min)	Recuperação (%)
Adenovírus em lisado celular bruto	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	27X	20	>100
Adenovírus purificado, em 1 M de tampão de sal	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	45X	10	85
AAV em lisado celular bruto	Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 107	4	20X	35	50
AAV em lisado celular bruto	Amicon® Ultra-15 50 kDa	2 x 107	10	25X	45	76
AAV diluído em Tris de 100 mm, tampão NaCl de 250 mm	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
Lentivirus em sobrenadante da cultura celular	Amicon® Ultra-4 100 kDa	9 x 104	4	100X	30	>100
Lentivirus em sobrenadante da cultura celular	Amicon® Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	100X	30	93
Lentivirus em sobrenadante da cultura celular	Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

É importante lembrar que a maioria dos vírus não pode estar eficientemente concentrada e armazenada em tampões com baixo teor de sal. A concentração centrífuga do vírus em soluções salinas inferiores a 250 mm leva à agregação do vírus e à diminuição da infecciosidade.

O estoque viral concentrado pode ser esterilizado por filtro através de filtros de 0,22 µm. As unidades Ultrafree^®-MC GV filter unitspodem ser usados para volumes de < 0,5 mL.

Conclusões

Desenvolvemos um método para validar a ultrafiltração utilizando os dispositivos Amicon^® Ultra e Centricon^® Plus centrifugal como um meio rápido e econômico para obter elevados títulos de vírus. Este método pode ser usado para concentrar vírus de sobrenadantes da cultura celular, lisados celulares e outras fontes. Após a concentração, o estoque viral pode ser esterilizado por filtração usando unidades de Ultrafree^® filter. Para uma maior recuperação de partículas virais infecciosas, é fundamental selecionar o dispositivo de ultrafiltração adequado, filtro de membrana, corte de peso molecular (MWCO), velocidade de centrifugação e tempo de centrifugação.

Dispositivos de ultrafiltração centrífuga

Limite de peso molecular nominal do dispositivo, NMWL (kDa)	Dispositivos Amicon® Ultra centrifugal ultrafiltration				Dispositivos Centricon® Plus 70 centrifugal
	0,5 mL	2 ml	4 mL	15 mL	15 – 70 mL
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* Registrado para uso IVD