Protocolos ELISA

• Procedimento de ensaio sanduíche
• Procedimento de ensaio de fosforilação
• Procedimento de ensaio EIA
• Procedimento de ensaio baseado em células

Procedimento de ensaio sanduíche

1. Deixe todos os reagentes e amostras em temperatura ambiente (18 - 25 °C) antes de usar. Recomenda-se que todos os padrões e amostras sejam analisados pelo menos em duplicata.
2. Adicione 100 μl de cada padrão e amostra nos poços apropriados. Cubra os poços e incube durante 2,5 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C com agitação suave.
3. Descarte a solução e lave 4 vezes com solução de lavagem 1X. Lave enchendo cada poço com tampão de lavagem (300 μl) usando uma pipeta multicanal ou lavadora automática. A remoção completa do líquido em cada etapa é essencial para um bom desempenho. Após a última lavagem, remova qualquer tampão de lavagem restante por aspiração ou decantação. Inverta a lâmina e seque-a com uma toalha de papel limpa.
4. Adicione 100 μl de anticorpo de detecção preparado 1x em cada poço. Cubra os poços e incube durante 1 hora em temperatura ambiente com agitação suave.
5. Descarte a solução. Repita o procedimento de lavagem como na etapa 3.
6. Adicione 100 μl de solução preparada de estreptavidina em cada poço. Cubra os poços e incube durante 45 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
7. Descarte a solução. Repita a lavagem como na etapa 3.
8. Adicione 100 μl de reagente de substrato de etapa única TMB (item H) em cada poço. Cubra os poços e incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro com agitação suave.
9. Adicione 50 μl de solução de parada (item I) em cada poço. Leia a absorbância a 450 nm imediatamente.

Procedimento de ensaio de fosforilação

1. Deixe todos os reagentes em temperatura ambiente (18 - 25 °C) antes de usar. Recomenda-se que todas as amostras ou Controle positivo sejam analisados pelo menos em duplicata.
2. Adicione 100 μl de cada amostra ou controle positivo nos poços apropriados. Cubra bem com suporte de placa e incube por 2,5 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C com agitação.
3. Descarte a solução e lave 4 vezes com solução de lavagem 1X. Lave enchendo cada poço com tampão de lavagem (300 μl) usando uma pipeta multicanal ou lavadora automática. A remoção completa do líquido em cada etapa é essencial para um bom desempenho. Após a última lavagem, remova qualquer tampão de lavagem restante por aspiração. Inverta a lâmina e seque-a com uma toalha de papel limpa.
4. Adicione 100 μl de anticorpo anti-fosfotirosina biotinilado 1X preparado em cada poço. Incube durante 1 hora em temperatura ambiente com agitação.
5. Descarte a solução. Repita a lavagem como na etapa 3.
6. Adicione 100 μl de solução preparada de 1X HRP-estreptavidina (consulte a etapa 6 de preparação de reagentes) em cada poço. Incube durante 45 minutos em temperatura ambiente com agitação.
7. Descarte a solução. Repita a lavagem como na etapa 3.
8. Adicione 100 μl de reagente de substrato de etapa única TMB (item H) em cada poço. Incube durante 30 minutos em temperatura ambiente no escuro com agitação.
9. Adicione 50 μl de solução de parada (item I) em cada poço. Leia a 450 nm imediatamente.

Procedimento de ensaio EIA

1. Mantenha os reagentes do kit no gelo durante as etapas de preparação dos reagentes. Recomenda-se que todos os padrões e amostras sejam analisados pelo menos em duplicata.
2. Adicione 100 μl de anticorpo anti-“alvo” em cada poço. Incube durante 1,5 horas em temperatura ambiente com agitação suave (1-2 ciclos/seg). Você também pode incubar durante a noite a 4 °C.
3. Descarte a solução e lave os poços 4 vezes com 1x tampão de lavagem (200-300 μl cada). A lavagem pode ser feita com uma pipeta multicanal ou um lavador automático de lâminas. A remoção completa do líquido em cada etapa é essencial para um bom desempenho do ensaio. Após a última lavagem, remova qualquer tampão de lavagem restante por aspiração ou decantação. Inverta a lâmina e seque-a com uma toalha de papel limpa.
4. Adicione 100 μl de cada padrão, controle positivo e amostra nos poços apropriados. Certifique-se de incluir um poço em branco (somente Diluente de Ensaio). Cubra os poços e incube durante 2,5 horas em temperatura ambiente com agitação suave (1-2 ciclos/seg) ou durante a noite a 4 °C.
5. Descarte a solução e lave 4 vezes conforme indicado na Etapa 3.
6. Adicione 100 μl de solução preparada de HRP-estreptavidina em cada poço. Incube durante 45 minutos com agitação suave em temperatura ambiente. Recomenda-se que o tempo de incubação não seja inferior nem superior a 45 minutos.
7. Descarte a solução e lave 4 vezes conforme indicado na Etapa 3.
8. Adicione 100 μl de reagente de substrato de uma etapa única TMB (item H) em cada poço. Incube durante 30 minutos em temperatura ambiente no escuro com agitação suave (1-2 ciclos/seg).
9. Adicione 50 μl de solução de parada (item I) em cada poço. Leia as absorbâncias a 450 nm imediatamente.

Procedimento de ensaio baseado em células

OBSERVAÇÃO: TODAS as incubações e etapas de lavagem devem ser realizadas sob agitação ou rotação suave (~1‐2 ciclos/seg).

1. Projete seu experimento.
   OPCIONAL: Se for cultivar HUVECs, HMEC-1 ou outras células frouxamente ligadas, cubra a microplaca não revestida de 96 poços (ITEM A) adicionando 100 μl de poli-L-lisina (produto Sigma-Aldrich recomendado nº P4832) em cada poço e siga as instruções do fabricante. Uma microplaca CellBIND^® pré-revestida ou outra placa de cultura de tecidos tratada com polilisina pode ser usada no lugar do ITEM A.
2. Disperse 100 μl de 10.000 a 30.000 células em cada poço da microplaca não revestida de 96 poços (ITEM A) fornecida e incube durante a noite a 37°C com 5% de CO₂.
   OBSERVAÇÃO: O número ideal de células utilizadas variará de acordo com a linhagem celular e a quantidade relativa de fosforilação da proteína. Podem ser utilizadas mais ou menos células, mas isto deve ser determinado empiricamente. OBSERVAÇÃO: As células podem ficar sem soro por cerca de 4 a 24 horas (dependendo da linhagem celular) antes do tratamento com inibidores ou ativadores.         
3. Aplicar vários tratamentos, inibidores (como siRNA ou produtos químicos) ou ativadores de acordo com as instruções do fabricante e incubar durante os pontos no tempo desejados. 
   OBSERVAÇÃO: Recomenda-se dissolver inibidores ou ativadores em meio de cultura celular isento de soro antes de tratar as células (a menos que indicado de outra forma nas instruções do fabricante).       
4. Descarte o meio de cultura celular virando a microplaca de cabeça para baixo e batendo suavemente na parte inferior da microplaca sobre uma pia.
5. Lave pipetando 200 μl do tampão de lavagem A 1X (ITEM B) preparado em cada poço. Descarte o tampão de lavagem (igual a etapa 4) e lave mais 2 vezes, atingindo um total de 3 lavagens usando um tampão de lavagem novo cada vez. Após a lavagem final, seque suavemente a microplaca sobre uma toalha de papel para remover qualquer excesso/tampão restante.
   OBSERVAÇÃO: Para evitar a perda de células, não pipete diretamente nas células. Em vez disso, distribua suavemente o líquido pela parede dos poços de cultura celular. Evite também o uso de sucção a vácuo ou bater com muita força na microplaca ao descartar qualquer solução.       
6. Adicione 100 μl de solução fixadora (ITEM D) em cada poço e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
   OBSERVAÇÃO: A solução fixadora é usada para permeabilizar as células.  
7. Repita a etapa de lavagem 5.
8. Adicione 200 μl de tampão de resfriamento 1X preparado (ITEM E) em cada poço e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
   OBSERVAÇÃO: O tampão de resfriamento é usado para minimizar a resposta de fundo.  
9. Lave 4 vezes com o tampão de lavagem A 1X.
10. Adicione 200 μl do tampão de bloqueio 1X preparado (ITEM F) em cada poço e incube por 1 hora a 37 °C. 
    
11. Lave 3 vezes com o tampão de lavagem 1X B preparado (ITEM C).
    OBSERVAÇÃO: Se necessário, a microplaca pode ser armazenada a ‐80 °C durante vários dias após esta lavagem.
12. Adicione 50 μl do anticorpo primário 1X preparado (ITEM G-1, G-2, G-3, H-1, H-2 ou H-3) em cada poço correspondente e incube por 2 horas em temperatura ambiente.
13. Lave 4 vezes com tampão de lavagem 1X B.
14. Adicione 50 μl do anticorpo secundário conjugado HRP 1X preparado (ITEM I-2) em cada poço e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
15. Repita a etapa 13.
16. Adicione 100 μl do substrato TMB (ITEM J) em cada poço e incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
17. Adicione 50 μl da solução de parada (ITEM K) em cada poço. Leia a 450 nm imediatamente.

Esses protocolos destinam-se a ser usados apenas como orientação. Consulte o boletim técnico detalhado de cada kit para obter instruções específicas.