Método padrão recomendado para o isolamento de células mononucleares

A separação de células usando os produtos Ficoll-Paque pode ser realizada em uma ampla gama de volumes de amostras de sangue. Com seu alto rendimento, esse método pode ser adaptado ao processamento de quantidades muito pequenas de sangue, como as que podem ser obtidas de crianças. Para obter a máxima reprodutibilidade da separação, recomenda-se o uso de um procedimento padronizado. O procedimento a seguir foi avaliado em nossos laboratórios com o Ficoll-Paque PLUS e é recomendado para a separação de amostras de sangue normal. Mudanças simples podem ser feitas facilmente para se adequar a um sistema de centrifugação específico. O mesmo procedimento é recomendado ao separar células usando Ficoll-Paque PREMIUM, Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 e Ficoll-Paque PREMIUM 1.073.

Para padronizar a técnica, o volume de sangue e o diâmetro do tubo de centrífuga devem ser escolhidos primeiro. Esses fatores determinam a altura da amostra de sangue no tubo e, consequentemente, o tempo de centrifugação. O aumento da altura da amostra de sangue no tubo aumenta a contaminação por glóbulos vermelhos. No entanto, a separação não é afetada de forma significativa pela alteração do diâmetro do tubo. Portanto, um volume maior pode ser separado com o mesmo grau de purificação em um tubo de diâmetro maior se a altura da amostra de sangue no tubo e o tempo de separação forem mantidos constantes.

O rendimento e o grau de pureza das células mononucleares dependem, em grande parte, da eficiência da remoção de hemácias.

Quando os eritrócitos no sangue total são agregados, algumas células mononucleares ficam presas nos aglomerados e, portanto, sedimentam com os eritrócitos. Essa tendência de prender as células mononucleares é reduzida pela diluição do sangue. A diluição proporciona um melhor rendimento das células mononucleares e reduz o tamanho dos aglomerados de hemácias. A agregação de eritrócitos é aumentada em temperaturas mais altas (37 °C), o que, consequentemente, diminui a produção de células mononucleares. Em temperaturas mais baixas (4 °C), no entanto, a taxa de agregação diminui, mas o tempo de separação aumenta, o que também diminui o rendimento das células mononucleares. Uma temperatura intermediária de 18 °C a 20 °C proporciona os melhores resultados.

Equipamentos e soluções necessários, mas não fornecidos

1. Solução salina balanceada estéril ou outras soluções salinas padrão (consulte Preparação de reagentes).
2. Centrífuga com rotor giratório (o freio deve estar desligado).
3. Tubos de centrífuga e pipetas estéreis.
4. Agulhas e seringas esterilizadas.
5. Solução de lise de hemácias de sua escolha (se estiver isolando granulócitos).

Preparo de reagentes

Solução diluente e de lavagem
A solução salina balanceada para diluição do sangue e lavagem das células pode ser feita de acordo com as instruções abaixo. Também podem ser usados outros diluentes e fluidos de lavagem, como solução salina isotônica tamponada com fosfato livre de Ca²⁺/Mg²⁺ (por exemplo, PBS de Dulbecco), soluções salinas (por exemplo, Hank's) ou meios de cultura de células (por exemplo, RPMI 1640).

Solução salina balanceada
Para preparar a solução salina balanceada, misture um volume de solução de estoque A com nove volumes de solução de estoque B e esterilize. Pelo menos 20 ml de cada amostra devem ser processados. Outras soluções salinas padrão estéreis também podem ser usadas.

Solução A	Concentração (M)	Concentração [g/l]
D-glucose anidra	5,5 × 10-3 M (0,1 %)	1,0
CaCl2.2H2O	5,0 × 10-5 M	0,0074
MgCl2.6H20	9,8 × 10-4 M	0,1992
KCl	5,4 × 10-3 M	0,4026
TRIS	0,145 m	17,565

Dissolva em aproximadamente 950 ml de água destilada e adicione HCl concentrado até que o pH seja 7,6 antes de ajustar o volume para 1 l.

Solução B	Concentração (M)	Concentração [g/l]
NaCl	0,14	8,19

Para preparar a solução salina balanceada, misture 1 volume da solução A com 9 volumes da solução B. Prepare a solução semanalmente. Outras soluções salinas padrão podem ser usadas.

Produto Ficoll-Paque
Aqueça o meio de gradiente de densidade Ficoll-Paque a 18 °C a 20 °C antes de usar. Para amostras maiores que 3 ml, consulte as Notas.

Preparação da amostra
Deve-se usar sangue fresco para garantir a alta viabilidade das células mononucleares isoladas. Prepare a amostra a 18 °C a 20 °C.

1. Em um tubo de centrífuga de 10 ml, adicione 2 ml de sangue desfibrinado ou tratado com anticoagulante e um volume igual de solução salina balanceada (volume final de 4 ml).
2. Misture o sangue e o tampão invertendo o tubo várias vezes ou puxando a mistura para dentro e para fora de uma pipeta.

Procedimento para isolamento de células mononucleares

1. Inverta o frasco de meio Ficoll-Paque várias vezes para garantir uma mistura completa.
   Para retirada do meio Ficoll-Paque por seringa: Retire a tampa de polipropileno e insira a agulha da seringa através do septo (Figura 1).
   Para retirada do meio Ficoll-Paque por pipeta: Remova a tampa de polipropileno de encaixe. Levante o anel de alumínio. Retire o lacre de metal. Remova o anel de prata.
   Remova o fecho de borracha. Usando técnicas assépticas, retire o volume necessário de meio Ficoll-Paque (Figura 2).
2. Adicione o meio Ficoll-Paque (3 ml) ao tubo de centrífuga.
3. Coloque cuidadosamente a amostra de sangue diluída (4 ml) sobre a solução de meio Ficoll-Paque (Figura 3).
   Importante: Ao colocar a amostra em camadas, não misture a solução de meio Ficoll-Paque e a amostra de sangue diluída.
4. Centrifugue a 400 g por 30 a 40 minutos a 18 °C a 20 °C (o freio deve ser desligado).
5. Retire a camada superior contendo plasma e plaquetas usando uma pipeta estéril, deixando a camada de células mononucleares intacta na interface (Figura 4 e Figura 5). A camada superior, que contém o plasma, pode ser guardada para uso posterior.
6. Transfira a camada de células mononucleares para um tubo de centrífuga estéril usando uma pipeta estéril.

Figura 1. Remoção da tampa de polipropileno e do anel de prata

Figura 2. Retirada do meio Ficoll-Paque

Figura 3. Amostra de sangue colocada em camadas sobre o meio Ficoll-Paque

Figura 4. Antes da remoção da camada superior.

Figura 5. Após a remoção da camada superior (plasma).

Lavagem do isolamento celular

1. Faça uma estimativa do volume das células mononucleares transferidas. Adicione pelo menos 3 volumes (~ 6 ml) de solução salina balanceada às células mononucleares no tubo de centrífuga.
2. Suspenda as células puxando-as suavemente para dentro e para fora de uma pipeta.
3. Centrifugue a 400 a 500 × g por 10 a 15 minutos a 18 °C a 20 °C.

Observação: A centrifugação em alta velocidade aumenta a recuperação de células mononucleares. No entanto, se for importante também se livrar das plaquetas, recomenda-se uma velocidade de centrifugação menor (60 a 100 × g).

1. Remova o sobrenadante.
2. Ressuspenda as células mononucleares em 6 a 8 ml de solução salina balanceada.
3. Centrifugue a 400 a 500 × g (ou 60 a 100 × g para remoção de plaquetas) por 10 minutos a 18 °C a 20 °C.
4. Remova o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet de células em meio apropriado para a aplicação.

Procedimento para isolamento de granulócitos

1. Realize a centrifugação de gradiente de densidade usando o meio Ficoll-Paque conforme descrito acima em Procedimento para isolamento de células mononucleares, etapas 1 a 6.
2. Retire a camada superior do meio Ficoll-Paque usando uma pipeta estéril, deixando a camada de células brancas de granulócitos acima da camada de células vermelhas do sangue intacta.
3. Colete a fina camada de células brancas dos granulócitos com uma pipeta e transfira para um tubo de centrífuga estéril.
4. Ressuspenda as células em pelo menos cinco volumes de solução salina balanceada e centrifugue a 400 × g por 15 minutos.
5. Lise os glóbulos vermelhos restantes com qualquer solução de lise de glóbulos vermelhos de sua escolha.
6. Centrifugue os granulócitos a 400 a 500 × g por 10 a 15 minutos a 18 °C a 20 °C.
7. Remova o sobrenadante.
8. Ressuspenda os granulócitos em 6 a 8 ml de solução salina balanceada.
9. Centrifugue a 400 a 500 × g por 10 minutos a 18 °C a 20 °C.
10. Remova o sobrenadante.
11. Ressuspenda o pellet de células em meio apropriado para a aplicação.

Observações
Anticoagulantes: heparina, EDTA, citrato, citrato ácido dextrose (ACD) e citrato fosfato dextrose (CPD) podem ser usados como anticoagulantes para a amostra de sangue. O sangue desfibrinado não requer anticoagulante. A desfibrinação, entretanto, resulta em um rendimento menor de células mononucleares e pode causar maior contaminação por hemácias³. Também causa a perda seletiva de monócitos.

Bøyum descobriu que uma preparação de células mononucleares ligeiramente mais pura é obtida usando EDTA em vez de heparina como anticoagulante³. Também foi observado na purificação de células mononucleares de outras fontes que não o sangue periférico que a adição de heparina pode causar a gelificação das suspensões celulares⁴. O sangue estabilizado com citrato pode resultar em RNA e DNA de melhor qualidade do que outros anticoagulantes e produzir um rendimento maior de células mononucleares. A heparina afeta a proliferação de células T e se liga a muitas proteínas. O EDTA é bom para ensaios baseados em DNA, mas influencia a concentração de Mg2+ e causa problemas na análise citogenética⁵. Também foi demonstrado que o rendimento de RNA é maior no sangue com EDTA do que no sangue com heparina⁶.

Volume sanguíneo: volumes maiores de sangue podem ser processados com a mesma eficiência de separação usando-se tubos de centrífuga de diâmetro maior, mantendo-se aproximadamente as mesmas alturas do meio Ficoll-Paque (2,4 cm) e da amostra de sangue (3,0 cm) que no método padrão descrito acima. O aumento do diâmetro do tubo não afeta o tempo de separação necessário.

Armazenamento de amostras de sangue: as amostras de sangue devem estar livres de coágulos e ser processadas o mais rápido possível após a coleta para garantir resultados ideais. Atrasos no processamento do sangue podem resultar em perda de viabilidade, menor recuperação de células e mais granulócitos e/ou eritrócitos contaminantes. De fato, foi relatado que o armazenamento por 24 horas em temperatura ambiente resulta na redução da produção de linfócitos, na alteração da expressão dos marcadores de superfície e na redução da resposta à estimulação mitogênica ^5,7,8. Remoção de células mortas: as células mortas são removidas durante o isolamento celular usando Ficoll-Paque PLUS^9,10,58.

Densidade e temperatura: a temperatura na qual as separações de gradiente de densidade são realizadas é naturalmente afetada pela temperatura ambiente, pela temperatura da centrífuga, pela temperatura do meio de gradiente de densidade e pela temperatura da amostra líquida. Às vezes, também pode haver confusão em relação ao que se entende por temperatura ambiente (por exemplo, na Europa pode ser 20 °C e na América do Norte > 20 °C). Sabe-se que as densidades dos produtos Ficoll-Paque diminuem com o aumento da temperatura. Por exemplo, o Ficoll-Paque PREMIUM (1,077 g/ml) exibe uma densidade de 1,0772, 1,0767 e 1,0758 a 20 °C, 22 °C e 25 °C, respectivamente.

Amostras patológicas de sangue: o método padrão descrito acima foi desenvolvido para a purificação de células mononucleares do sangue periférico de doadores humanos normais e saudáveis. Resultados diferentes podem ser obtidos com amostras coletadas de doadores com infecções ou outras condições patológicas, como câncer (consulte Outras aplicações do Ficoll-Paque PLUS e do Ficoll-Paque PREMIUM, página 12).

Remoção de plaquetas: se for importante remover todas as plaquetas da fração de células mononucleares, pode ser aplicada uma segunda centrifugação em um gradiente de sacarose de 4% a 20% sobre Ficoll-Paque PLUS. Esse procedimento removerá efetivamente qualquer contaminação por plaquetas¹¹. As plaquetas permanecerão na parte superior do gradiente de sacarose e as células mononucleares sedimentarão através do gradiente de sacarose até a parte superior da camada de Ficoll-Paque PLUS. Como alternativa, as plaquetas podem ser removidas por agregação com adenosina-5'-difosfato (ADP) antes de separar as células mononucleares¹².

Solução de problemas de desempenho inadequado
Se usados de acordo com o procedimento padrão recomendado, pode-se esperar que o Ficoll-Paque PLUS e o Ficoll-Paque PREMIUM proporcionem um isolamento sem problemas de células mononucleares do sangue periférico humano com resultados como os mostrados na página 2. Como mencionado anteriormente, o Ficoll-Paque PREMIUM 1.073 e o Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 levarão ao isolamento de preparações celulares com subconjuntos de células mononucleares de densidade ligeiramente diferente. No entanto, desvios em determinados parâmetros experimentais podem levar a resultados ruins, e o gráfico de solução de problemas apresentado aqui tem o objetivo de ajudar na rápida identificação e correção do problema que está causando a redução do desempenho.

Desvio no desempenho	Origem provável do problema	Comentários
Aumento das células vermelhas do sangue e contaminação dos linfócitos.	A. Temperatura muito baixa.	As densidades de todos os produtos Ficoll-Paque são maiores em baixa temperatura (consulte Observações, Densidade e temperatura) e os glóbulos vermelhos são menos agregados, de modo que os granulócitos e os glóbulos vermelhos são impedidos de entrar na camada de meio Ficoll-Paque. Aumente a temperatura para 18 °C a 20 °C.
	B. Velocidade de centrifugação muito lenta e/ou tempo de centrifugação muito curto.	Deve-se usar tempo e força g adequados para garantir a sedimentação completa das células não linfoides.
Baixo rendimento e viabilidade das células mononucleares.	Temperatura muito alta.	Os produtos Ficoll-Paque são menos densos em altas temperaturas e alguns linfócitos podem penetrar na camada de meio Ficoll-Paque. A viabilidade celular também pode ser afetada. Reduza a temperatura para 18 °C a 20 °C.
Baixo rendimento de células mononucleares com viabilidade normal.	Sangue não diluído 1:1 com solução salina balanceada; hematócrito anormalmente alto.	A alta densidade celular faz com que um grande número de linfócitos fique preso em agregados de hemácias. Diluir ainda mais a amostra de sangue.
Baixo rendimento de células mononucleares com aumento da contaminação por granulócitos.	Vibração do rotor da centrífuga, levando à agitação do gradiente.	A vibração pode causar a ampliação da faixa de células mononucleares e a mistura com as células subjacentes. Verifique se o rotor está devidamente balanceado. Escolha a velocidade do rotor para evitar frequências ressonantes naturais.
Baixo rendimento de células mononucleares, baixa viabilidade e contaminação por outros tipos de células.	A amostra contém células com densidades anormais; densidades diferentes das do sangue humano normal.	Pode ser encontrado em amostras de sangue patológicas, amostras de sangue não humano, amostras de sangue antigas ou amostras de outras fontes que não o sangue periférico. O Percoll™ PLUS, um meio para centrifugação de gradiente de densidade, pode ser mais adequado do que os produtos Ficoll-Paque para essas separações.

Referências

1. Böyum A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 9777-89.

2. Böyum A. 1968. Isolation of leucocytes from human blood – further observations. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 9731–50.

3. BØYUM A. 1976. Isolation of Lymphocytes, Granulocytes and Macrophages. 59-15. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1976.tb03851.x

4. Almeida AP, A. Beaven M. 1980. Gel formation with leucocytes and heparin. Life Sciences. 26(7):549-555. https://doi.org/10.1016/0024-3205(80)90318-5

5. Holland NT, Smith MT, Eskenazi B, Bastaki M. 2003. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543(3):217-234. https://doi.org/10.1016/s1383-5742(02)00090-x

6. Marteau J, Mohr S, Pfister M, Visvikis-Siest S. 2005. Collection and Storage of Human Blood Cells for mRNA Expression Profiling: A 15-Month Stability Study. 51(7):1250-1252. https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.048546

7. Kaplan J, Nolan D, Reed A. 1982. Altered lymphocyte markers and blastogenic responses associated with 24 hour delay in processing of blood samples. Journal of Immunological Methods. 50(2):187-191. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90224-1

8. Imeri F, Herklotz R, Risch L, Arbetsleitner C, Zerlauth M, Risch GM, Huber AR. 2008. Stability of hematological analytes depends on the hematology analyser used: A stability study with Bayer Advia 120, Beckman Coulter LH 750 and Sysmex XE 2100. Clinica Chimica Acta. 397(1-2):68-71. https://doi.org/10.1016/j.cca.2008.07.018

9. Paietta E. 2003. How to optimize multiparameter flow cytometry for leukaemia/lymphoma diagnosis. Best Practice & Research Clinical Haematology. 16(4):671-683. https://doi.org/10.1016/s1521-6926(03)00070-7

10. Dolan BP, Gibbs KD, Ostrand-Rosenberg S. 2006. Dendritic Cells Cross-Dressed with Peptide MHC Class I Complexes Prime CD8+ T Cells. J Immunol. 177(9):6018-6024. https://doi.org/10.4049/jimmunol.177.9.6018

11. Perper RJ, Zee TW, Mickelson MM. 1968. Purification of lymphocytes and platelets by gradient centrifugation. J Lab Clin Med. 72(5):842-8.

12. VIVES J, PARRA M, CASTILLO R. Platelet Aggregation Technique Used in the Preparation of Lymphocyte Suspensions. 1(6):276-278. https://doi.org/10.1111/j.1399-0039.1971.tb00106.x

13. Alexander EL, Titus JA, Segal DM. 1978. Quantitation of Fc receptors and surface immunoglobulin is affected by cell isolation procedures using plasmagel and Ficoll-Hypaque. Journal of Immunological Methods. 22(3-4):263-272. https://doi.org/10.1016/0022-1759(78)90034-0

14. Hokland P, Heron I. 1980. Analysis of the lymphocyte distribution during isopaque-ficoll isolation of mononuclear cells from human peropheral blood. Journal of Immunological Methods. 32(1):31-39. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90114-3

15. HOKLAND P, HERON I. 1980. The Isopaque-Ficoll Method Re-evaluated: Selective Loss of Autologous Rosette-forming Lymphocytes during Isolation of Mononuclear Cells from Human Peripheral Blood. Scand J Immunol. 11(3):353-356. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1980.tb00245.x

16. AssumpcióRomeu M, Mestre M, González L, Valls A, Verdaguer J, Corominas M, Bas J, Massip E, Buendia E. 1992. Lymphocyte immunophenotyping by flow cytometry in normal adults. Journal of Immunological Methods. 154(1):7-10. https://doi.org/10.1016/0022-1759(92)90206-9

17. Lin S, Chao H, Yan D, Huang Y. 2002. Expression of adhesion molecules on T lymphocytes in young children and infants - a comparative study using whole blood lysis or density gradient separation. Clin Lab Haematol. 24(6):353-359. https://doi.org/10.1046/j.1365-2257.2002.00462.x

18. Bain B, Pshyk K. 1973. Reactivity in mixed cultures of mononuclear leucocytes separated on Ficoll-Hypaque. Proceedings 7th Leucocyte Culture Conference; New York Academic Press. p. 29–37.

19. Wu Y, Lu H, Cai J, He X, Hu Y, Zhao H, Wang X. 2009. Membrane Surface Nanostructures and Adhesion Property of T Lymphocytes Exploited by AFM. Nanoscale Res Lett. 4(8):942-947. https://doi.org/10.1007/s11671-009-9340-8

20. Guia S, Cognet C, de Beaucoudrey L, Tessmer MS, Jouanguy E, Berger C, Filipe-Santos O, Feinberg J, Camcioglu Y, Levy J, et al. 2008. A role for interleukin-12/23 in the maturation of human natural killer and CD56+ T cells in vivo. 111(10):5008-5016. https://doi.org/10.1182/blood-2007-11-122259

21. Frelin C. 2005. Targeting NF- B activation via pharmacologic inhibition of IKK2-induced apoptosis of human acute myeloid leukemia cells. Blood. 105(2):804-811. https://doi.org/10.1182/blood-2004-04-1463

22. van den Akker ELT, Baan CC, van den Berg B, Russcher H, Joosten K, Hokken-Koelega ACS, Lamberts SWJ, Koper JW. 2008. Ficoll-separated mononuclear cells from sepsis patients are contaminated with granulocytes. Intensive Care Med. 34(5):912-916. https://doi.org/10.1007/s00134-007-0989-0

23. Chan JK, Hamilton CA, Anderson EM, Cheung MK, Baker J, Husain A, Teng NN, Kong CS, Negrin RS. 2007. A novel technique for the enrichment of primary ovarian cancer cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197(5):507.e1-507.e5. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2007.05.006

24. Kluin-Nelemans JC, van-Helden HP. 1980. Non-lymphoid cells obtained by the Böyum technique and their significance in cancer patients. J Clin Lab Immunol. 4(2):99-102.

25. Minami R, Yokota S, Teplitz RL. 1978. Gradient separation of normal and malignant cells. II. Application to in vivo tumor diagnosis. Acta Cytol. 22(6):584-8.

26. Chang H, Jones OW, Bradshaw C, Sarkar S, Porreco RP. 1981. Enhancement of human amniotic cell growth by ficoll-paque gradient fractionation. In Vitro. 17(1):81-90. https://doi.org/10.1007/bf02618035

27. Kekarainen T, Mannelin S, Laine J, Jaatinen T. 2006. BMC Cell Biol. 7(1):30. https://doi.org/10.1186/1471-2121-7-30

28. Briquet A, Dubois S, Bekaert S, Dolhet M, Beguin Y, Gothot A. 2010. Prolonged ex vivo culture of human bone marrow mesenchymal stem cells influences their supportive activity toward NOD/SCID-repopulating cells and committed progenitor cells of B lymphoid and myeloid lineages. Haematologica. 95(1):47-56. https://doi.org/10.3324/haematol.2009.008524

29. Malanga D, Barba P, Harris PE, Maffei A, Del Pozzo G. 2007. The active translation of MHCII mRNA during dendritic cells maturation supplies new molecules to the cell surface pool. Cellular Immunology. 246(2):75-80. https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2007.06.003

30. Ciccocioppo R, Ricci G, Rovati B, Pesce I, Mazzocchi S, Piancatelli D, Cagnoni A, Millimaggi D, Danova M, Corazza GR. Reduced number and function of peripheral dendritic cells in coeliac disease. 149(3):487-496. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2007.03431.x

31. Hattar K, van Bürck S, Bickenbach A, Grandel U, Maus U, Lohmeyer J, Csernok E, Hartung T, Seeger W, Grimminger F, et al. 2005. Anti-proteinase 3 antibodies (c-ANCA) prime CD14-dependent leukocyte activation. Journal of Leukocyte Biology. 78(4):992-1000. https://doi.org/10.1189/jlb.0902442

32. Lubin I, Faktorowich Y, Lapidot T, Gan Y, Eshhar Z, Gazit E, Levite M, Reisner Y. 1991. Engraftment and development of human T and B cells in mice after bone marrow transplantation. Science. 252(5004):427-431. https://doi.org/10.1126/science.1826797

33. Flaherty MP, Abdel-Latif A, Li Q, Hunt G, Ranjan S, Ou Q, Tang X, Johnson RK, Bolli R, Dawn B. 2008. Noncanonical Wnt11 Signaling Is Sufficient to Induce Cardiomyogenic Differentiation in Unfractionated Bone Marrow Mononuclear Cells. Circulation. 117(17):2241-2252. https://doi.org/10.1161/circulationaha.107.741066

34. Kawka DW, Ouellet M, Hétu P, Singer II, Riendeau D. 2007. Double-label expression studies of prostacyclin synthase, thromboxane synthase and COX isoforms in normal aortic endothelium. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1771(1):45-54. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2006.09.015

35. Zhang Y, Lin H, Frimberger D, Epstein RB, Kropp BP. 2005. Growth of bone marrow stromal cells on small intestinal submucosa: an alternative cell source for tissue engineered bladder. BJU Int. 96(7):1120-1125. https://doi.org/10.1111/j.1464-410x.2005.05741.x

36. Yang G, Qiu C, Zhao H, Liu Q, Shao Y. 2006. Expression of mRNA for multiple serotonin (5-HT) receptor types/subtypes by the peripheral blood mononuclear cells of rhesus macaques. Journal of Neuroimmunology. 178(1-2):24-29. https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2006.05.016

37. Xu R, Jiang X, Guo Z, Chen J, Zou Y, Ke Y, Zhang S, Li Z, Cai Y, Du M, et al. 2008. Functional Analysis of Neuron-like Cells Differentiated from Neural Stem Cells Derived from Bone Marrow Stroma Cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 28(4):545-558. https://doi.org/10.1007/s10571-007-9174-9

38. Pearson TW, Roelants GE, Lundin LB, Mayor-Withey KS. 1979. The bovine lymphoid system: Binding and stimulation of peripheral blood lymphocytes by lectins. Journal of Immunological Methods. 26(3):271-282. https://doi.org/10.1016/0022-1759(79)90252-7

39. Yang TJ, Jantzen PA, Williams LF. 1979. Acid alpha-naphthyl acetate esterase: presence of activity in bovine and human T and B lymphocytes. Immunology. 38(1):85–93.

40. Di Cesare S, Maloney S, Fernandes BF, Martins C, Marshall J, Antecka E, Odashiro AN, Dawson WW, Burnier MN. 2009. The effect of blue light exposure in an ocular melanoma animal model. J Exp Clin Cancer Res. 28(1): https://doi.org/10.1186/1756-9966-28-48

41. Hueso P, Rocha M. 1978. Comparative study of six methods for lymphocyte isolation from several mammalian sources and determination of their carbohydrate composition. Rev Esp Fisiol. 34(3):339-44.

42. Li X, Zhong Z, Liang S, Wang X, Zhong F. 2009. Effect of cryopreservation on IL-4, IFN? and IL-6 production of porcine peripheral blood lymphocytes. Cryobiology. 59(3):322-326. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2009.09.004

43. Blaxhall PC. 1981. A comparison of methods used for the separation of fish lymphocytes. J Fish Biology. 18(2):177-181. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.1981.tb02812.x

44. Brandslund I, Rasmussen JM, Fisker D, Svehag S. 1982. Separation of human peripheral blood monocytes on continuous density gradients of polyvinylpyrrolidone-coated silica gel (Percoll®). Journal of Immunological Methods. 48(2):199-211. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90194-6

45. Feucht H, Hadam M, Frank F, Riethmüller G. 1980. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (Percoll). Journal of Immunological Methods. 38(1-2):43-51. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90329-4

46. Mizobe F, Martial E, Colby-Germinario S, Livett BG. 1982. An improved technique for the isolation of lymphocytes from small volumes of peripheral mouse blood. Journal of Immunological Methods. 48(3):269-279. https://doi.org/10.1016/0022-1759(82)90327-1

47. Sato J, Kawano Y, Takaue Y, Hirao A, Makimoto A, Okamoto Y, Abe T, Kuroda Y, Shimokawa T, Iwai A. 1995. Quantitative and qualitative comparative analysis of gradient‐separated hematopoietic cells from cord blood and chemotherapy‐mobilized peripheral blood. Stem Cells. 13(5):548-555. https://doi.org/10.1002/stem.5530130513

48. EU GMP Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products. [Internet].[updated 10 Jan 2008]. Available from: https://www.gmp-compliance.org/guidemgr/files/annex%2001[2008].pdf

49. <1043> ANCILLARY MATERIALS FOR CELL, GENE, AND TISSUE-ENGINEERED PRODUCTS. [Internet]. Available from: https://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_c1043

50. Leene W, Roholl PJM, Hoeben KA. 1982. Lymphocyte Differentiation in the Rabbit Thymus.319-325. https://doi.org/10.1007/978-1-4684-9066-4_44

51. BOYUM A, LOVHAUG D, TRESLAND L, NORDLIE EM. 1991. Separation of Leucocytes: Improved Cell Purity by Fine Adjustments of Gradient Medium Density and Osmolality. Scand J Immunol. 34(6):697-712. https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.1991.tb01594.x

52. Archambault D, Morin G, Elazhary M. 1988. Isolation of bovine colostral lymphocytes: in vitro blastogenic responsiveness to concanavalin A and bovine rotavirus. Ann Rech Vet. 19(3):169-74.

53. Van Riper G, Siciliano S, Fischer PA, Meurer R, Springer MS, Rosen H. 1993. Characterization and species distribution of high affinity GTP-coupled receptors for human rantes and monocyte chemoattractant protein 1.. 177(3):851-856. https://doi.org/10.1084/jem.177.3.851

54. Chin S, Poey AC, Wong C, Chang S, Teh W, Mohr TJ, Cheong S. 2010. Cryopreserved mesenchymal stromal cell treatment is safe and feasible for severe dilated ischemic cardiomyopathy. Cytotherapy. 12(1):31-37. https://doi.org/10.3109/14653240903313966

55. Garayoa M, Garcia JL, Santamaria C, Garcia-Gomez A, Blanco JF, Pandiella A, Hernández JM, Sanchez-Guijo FM, del Cañizo M, Gutiérrez NC, et al. 2009. Mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients display distinct genomic profile as compared with those from normal donors. Leukemia. 23(8):1515-1527. https://doi.org/10.1038/leu.2009.65

56. Grisendi G, Annerén C, Cafarelli L, Sternieri R, Veronesi E, Cervo GL, Luminari S, Maur M, Frassoldati A, Palazzi G, et al. 2010. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12(4):466-477. https://doi.org/10.3109/14653241003649510

57. Brooke G, Rossetti T, Pelekanos R, Ilic N, Murray P, Hancock S, Antonenas V, Huang G, Gottlieb D, Bradstock K, et al. 2009. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. 144(4):571-579. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2008.07492.x

58. Miltenyi S, Müller W, Weichel W, Radbruch A. 1990. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11(2):231-238. https://doi.org/10.1002/cyto.990110203

59. Mauldin JP, Nagelin MH, Wojcik AJ, Srinivasan S, Skaflen MD, Ayers CR, McNamara CA, Hedrick CC. 2008. Reduced Expression of ATP-Binding Cassette Transporter G1 Increases Cholesterol Accumulation in Macrophages of Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Circulation. 117(21):2785-2792. https://doi.org/10.1161/circulationaha.107.741314

60. Ali H, Jurga M, Kurgonaite K, Forraz N, McGuckin C. 2009. Defined serum-free culturing conditions for neural tissue engineering of human cord blood stem cells. Acta Neurobiol Exp (Wars). 69(1):12-23.

61. Figueroa-Tentori D, Querol S, Dodi IA, Madrigal A, Duggleby R. 2008. High purity and yield of natural Tregs from cord blood using a single step selection method. Journal of Immunological Methods. 339(2):228-235. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.09.019