Protocole de PCR standard

Comment réaliser une PCR ?

Une amplification en chaîne par polymérase (PCR pour "Polymerase Chain Reaction") standard se déroule en quatre étapes :

1. Ajouter les réactifs nécessaires, ou le mélange maître, et la matrice dans les tubes pour PCR.
2. Mélanger et centrifuger.
   * Dans un thermocycleur sans couvercle chauffant, ajouter de l'huile minérale pour éviter l'évaporation du mélange.
3. Amplifier l'ADN selon les paramètres du thermocycleur et les propriétés des amorces.
4. Analyser l'ADN amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium.

Ces étapes sont détaillées ci-dessous. Vous trouverez également la liste des produits nécessaires ainsi que des conseils pour le choix des réactifs. Il s'agit d'un protocole de PCR de base utilisant une Taq polymérase.

Étapes et principaux ingrédients d'une PCR

De nombreux facteurs entrent en jeu dans la résolution des problèmes de PCR. Regardez l'animation suivante pour comprendre comment le choix des bons ingrédients et des conditions de thermocyclage adaptées à vos besoins peut contribuer à optimiser vos résultats.

Retrouvez d'autres protocoles, pour d'autres polymérases ou des techniques de PCR avancées, dans la partie Protocoles de notre guide sur les technologies de PCR.

Pour aller plus loin et savoir notamment ce qu'est une PCR standard, nous vous invitons à consulter notre page sur les principes de base de la PCR.

Réactifs nécessaires pour la PCR

Réactif utilisé	Produit recommandé
Taq polymérase	Choisir la Taq polymérase selon les préférences de l'utilisateur (voir le tableau ci-après)
Eau de qualité PCR	Eau pour réactifs de PCR
Amorces diluées à la concentration de travail	Des solutions de travail de 10 µM suffisent pour la plupart des tests
Oligonucléotides	Oligonucléotides sur mesure
ADN à amplifier	Fourni par le chercheur
Pipettes spéciales
Thermocycleur	Avec différentes tailles de portoirs ou en multiformat
Pointes de pipettes stériles avec filtre
Tubes à centrifuger stériles de 1,5 ml avec bouchon à vis	Tubes à centrifuger Corning® avec bouchon à vis
Plaques ou tubes pour PCR	À choisir selon le type de thermocycleur :
	Tubes pour PCR individuels de 200 µl à paroi mince
	Tubes de 200 µl en barrettes
	Plaques multipuits et film adhésif
Mélange de dNTP	Mélange de désoxynucléotides contenant les éléments suivants à 10 mM : dATP, dCTP, dGTP et dTTP * Les mélanges prêts à l'emploi contiennent déjà les dNTP

Qu'est-ce que la Taq polymérase ?

La Taq polymérase est une enzyme thermostable issue de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Elle est généralement utilisée en PCR pour amplifier des fragments d'ADN. Elle se présente sous une forme recombinante exprimée dans E. coli. Cette enzyme est capable de résister à plusieurs cycles de chauffage à 95 °C (requis par la technique de PCR), sans perte d'activité significative. Elle présente un poids moléculaire d'environ 94 kDa par SDS-PAGE, sans activité endonucléase ou exonucléase détectable. Elle possède une activité ADN polymérase 5'→3' et une activité exonucléase 5'→3'. Chaque lot de Taq polymérase est testé pour la PCR et le séquençage de l'ADN double brin. Cette enzyme est fournie en concentration de 5 unités par microlitre ; elle est accompagnée d'un tampon de réaction concentré 10 × et optimisé.

Taq polymérase classique

Utilisez le tableau ci-dessous pour choisir un mélange de Taq polymérase adapté aux conditions de votre réaction. Vous avez le choix entre des formulations incolores ou rouges, avec ou sans chlorure de magnésium (MgCl₂), ou un mélange maître (également appelé mélange prêt à l'emploi, prémélange ou mélange ReadyMix™) contenant un tampon et des dNTP.

Avec MgCl2		MgCl2 fourni à part	Mélange prêt à l'emploi
Formulation incolore sans colorant	Avec colorant rouge pour dépôt direct sur gels	Formulation incolore sans colorant	Avec colorant rouge pour dépôt direct sur gels	Formulation incolore sans colorant
Taq polymérase de Thermus aquaticus (D1806)	ADN polymérase REDTaq® (D4309)	Taq polymérase de Thermus aquaticus sans MgCl2 (D4545)	Mélange pour PCR ReadyMix™ REDTaq® (R2523)	Mélange pour PCR ReadyMix™ Taq (P4600)

Définition d'une unité : Une unité incorpore, en 30 minutes et à 74 °C, 10 nmol de désoxyribonucléosides triphosphates totaux dans un ADN insoluble en milieu acide.

Protocole : la PCR pas à pas

Les conditions optimales pour la concentration de Taq polymérase, d'ADN matrice, d'amorces et de MgCl₂ varient selon le système utilisé. Il faut parfois déterminer ces conditions pour chacun des ingrédients. Cela vaut tout particulièrement pour la Taq polymérase, les paramètres de thermocyclage et la concentration de MgCl₂. Il est recommandé de titrer l'enzyme et le MgCl₂ pour déterminer leur efficacité optimale.

1. Ajouter les réactifs dans un tube de taille appropriée, en respectant l'ordre indiqué dans le tableau (veiller à utiliser le tableau correspondant à la configuration de la réaction : standard ou avec mélange prêt à l'emploi). Lorsqu'un grand nombre de réactions doivent être réalisées, il est conseillé de préparer un mélange maître sans matrice et de le répartir dans les tubes réactionnels, la matrice étant ajoutée à la fin dans les tubes appropriés.
   

PCR standard

Quantité	Ingrédient	Concentration finale
w µl	Eau
5 µl	Tampon de PCR concentré 10 × (P2192 ou P2317)*	1 ×
1 µl	Mélange de désoxynucléotides	200 µM
w µl	Amorce sens (généralement de 15 à 30 bases de long)	0,1 à 0,5 µM
x µl	Amorce antisens (généralement de 15 à 30 bases de long)	0,1 à 0,5 µM
0,5 µl	Taq polymérase*	0,05 unité/µl
y µl	ADN matrice (généralement 10 ng)	200 pg/µl
z µl	MgCl2 25 mM (à utiliser uniquement avec le tampon P2317)	0,1 à 0,5 mM
50 µl	Volume réactionnel total

* Acheter le tampon et la Taq polymérase ensemble : D1806, D4309 ou D4545.

PCR avec mélange prêt à l'emploi

Quantité	Ingrédient	Concentration finale
25 µl	Mélange ReadyMix™ (R2523 ou P4600)
w µl	Amorce sens (généralement de 15 à 30 bases de long)	0,1 à 0,5 µM
x µl	Amorce antisens (généralement de 15 à 30 bases de long)	0,1 à 0,5 µM
y µl	ADN matrice (généralement 10 ng)	200 pg/µl
z µl	Eau
50 µl	Volume réactionnel total

2. Mélanger doucement au vortex et centrifuger brièvement afin que tous les composants se déposent au fond du tube.

Remarque : En cas d'utilisation d'un thermocycleur sans couvercle chauffant, ajouter 50 µl d'huile minérale en haut de chaque tube pour éviter l'évaporation du mélange.

3. Amplifier l'ADN. Les paramètres d'amplification varient en fonction des amorces et du thermocycleur utilisés. Il peut être nécessaire d'optimiser le système en fonction des amorces, de la matrice et du thermocycleur utilisés.

Paramètres de thermocyclage standards

Il est recommandé d'effectuer 25 à 30 cycles d'amplification.

Étape de la PCR	Température (°C)	Durée
Dénaturation de la matrice	94 °C	1 min
Hybridation des amorces	55 °C	2 min
Élongation	72 °C	3 min

4. L'ADN amplifié peut être analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium.

      Remarque : La couche d'huile minérale peut être éliminée par une seule extraction au chloroforme (1:1), rétablissant ainsi la phase aqueuse.

Réactifs nécessaires pour l'électrophorèse des acides nucléiques

• Agarose (gels précoulés, poudre, etc.)
• Tampon, p. ex. MOPS-EDTA-acétate de sodium, tris-acétate-EDTA (TAE) ou tris-borate-EDTA (TBE)
• Solution de dépôt sur gel et tampon de charge d'échantillon pour ARN
• Colorant pour électrophorèse, p. ex. bromure d'éthidium

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Mention relative aux droits d'exploitation figurant sur l'étiquette

AVERTISSEMENT À L'ATTENTION DE L'ACHETEUR : DROITS D'EXPLOITATION

L'achat de ce produit ne confère aucun droit d'exploitation sur les brevets US n^o 5 804 375, 5 994 056, 6 171 785, 6 214 979, 5 538 848, 5 723 591, 5 876 930, 6 030 787 et 6 258 569, ou les brevets correspondants en-dehors des États-Unis, ou tout autre brevet ou demande de brevet ayant trait aux procédés utilisant un colorant se fixant à l'ADN double brin et la nucléase 5'. Pour de plus amples informations, veuillez contacter le directeur chargé des questions de licences chez Applied Biosystems (850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404, États-Unis).