FAQs zu GenElute™-E Kits für die Einzel-Spin DNA-/RNA-Aufreinigung

Nachstehend finden Sie eine Liste häufig gestellter Fragen (FAQs) zu den GenElute™-E Kits für die Einzel-Spin DNA-/RNA-Aufreinigung.

Technologie-FAQs

FAQs zur Anwendung

Protokoll-FAQs

In den GenElute-E Kits für die Einzel-Spin DNA-/RNA-Aufreinigung wird die Negativ-Chromatographie zur Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt. Können Sie erklären, wie durch diesen Ansatz Arbeitsabläufe vereinfacht werden?

Anstelle der Optimierung der Bindungs-, Wasch- und Freisetzungsschritte in konventionellen, auf Kieselgel basierenden Spin-Aufreinigungsverfahren konzentriert sich die Technologie auf eine Trennung in Form einer einstufigen Fraktionierung auf Basis der Größe der Biomoleküle, was zu einer Abreicherung von Verunreinigungen führt.

Was ist so besonders an den SmartLyse-Enzymen?

Durch zielgerichtete SmartLyse™ Enzyme wird die Lysezeit verkürzt und ein effizienterer Arbeitsablauf ermöglicht, der Wissenschaftler vom mühsamen Handling von Röhrchen befreit, da Bindungs- und Waschschritte entfallen.

Bei der Verwendung von Kieselgelsäulen zur Aufreinigung können Wissenschaftler oft mit einem kleineren Volumen eluieren, um damit eine konzentriertere Probe zu erhalten, oder zweimal eluieren, um eine höhere Ausbeute zu erzielen. Worin unterscheidet sich diese Technologie?

Bei der Elution mit einem kleineren Volumen unter Verwendung von Kieselgel kann eine höhere Konzentration erreicht werden. Allerdings sind auch Restsalze und Ethanol, die zum Binden und Waschen der Probe benötigt werden, in höherer Konzentration vorhanden. Bei der Negativ-Chromatographie ist das zu ladende Volumen im Wesentlichen das Volumen, das zurückgewonnen wird (typischerweise ~80-100 µl). Dieses ist in der Regel konzentrierter als es bei mit Kieselgel isolierten Nukleinsäureproben der Fall ist. Bei Kieselgel werden durch eine zweite Elution in der Regel mehr Prozessverunreinigungen und kleinere Nukleinsäurefragmente freigesetzt, was zu einer ungenauen Quantifizierung und zu einer Überschätzung der Ausbeute führen kann.

Wie wird durch die GenElute-E Technologie die Genauigkeit der Nukleinsäurequantifizierung verbessert?

Bei der Aufreinigung mittels Negativ-Chromatographie werden keine Prozessverunreinigungen eingebracht und durch die Verringerung der Zentrifugationsschritte werden mehr Nukleinsäuren in voller Länge wiedergefunden. Dadurch wird die Genauigkeit der Quantifizierung erhöht, die in nachgeschaltete Anwendungen einfließt, und Verunreinigungen eliminiert, welche die nachgeschaltete Anwendung selbst stören können, woraus robustere Versuchen resultieren.

Welche weiteren Vorteile bietet GenElute-E Forschenden?

Die Eliminierung von Bindungs- und Waschschritten ist ein nachhaltigerer Ansatz für die Isolierung von Nukleinsäuren, durch den die Menge an Plastikröhrchen und im Durchfluss erzeugte chemische Abfälle reduziert werden. Dies macht GenElute™-E zu einer nachhaltigen Option grüner Chemie, die für alle Beteiligten von Vorteil ist.

Ich verwende ein kompliziertes Amplifikationsenzym (Polymerase). Werden durch diese Technologie Mg+2-Ionen aus meinen Vorbereitungen entfernt?

Ja, sie werden entfernt! Durch die GenElute™-E Einzel-Spin Aufreinigungstechnologie werden Ionen depletiert und dadurch robustere nachgeschaltete enzymatische Reaktionen ermöglicht, da die Konzentration der Bestandteile des enzymatischen Puffers besser optimiert ist und keine "überraschenden" Inhibitoren vorhanden sind.

Wie ist die Zusammensetzung des Lysepuffers und des Klärpuffers nach dem Durchfließen des Harzes?

Durch das Vorhandensein von EDTA, SDS oder überschüssigem Salz kann meine PCR/Sequenzierungsreaktion beeinträchtigt werden...

Die Informationen über den Lysepuffer sind geschützt, aber wir können sagen, dass er frei von chaotropen Salzen ist. Die Harze sind Entsalzungsharze, sodass EDTA, SDS und Salze abgereichert werden. Das ist das Schöne an dieser Technologie!

Führt die Technologie zu Verzerrungen in der Probe?

GenElute™-E führt nicht zu Verzerrungen, wie sie bei einigen "Bindungs-Wasch-Eluierungs"-Technologien auftreten können, da die Technologie nach Größe trennt und nicht danach, was sich bindet und was freigesetzt wird.

Ist bekannt, wie stabil die aufgereinigte DNA nach mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen ist?

Dieser Wert schwankt aufgrund der Variabilität der Proben (Probenentnahme, Konzentration, Fragmentlänge, Sequenz [GC-Gehalt], Lagerung vor der Isolierung usw.). Der Puffer der Probe wird jedoch gegen einen im Kit enthaltenen Standard-Lagerpuffer (1X TE) ausgetauscht.

Erstens: Ist die Scherung und die Verringerung von Scherschäden, die mit mehreren Spins auf einer Spinsäule verbunden sind, für RNA relevant? Zweitens: Wie werden in der Negativ-Chromatographiesäule große negativ geladene Proteine/Glykoproteine ausgeschlossen, wenn Nukleinsäuren (insbesondere RNA) extrahiert werden sollen?

• RNA-Extraktionen sind anfällig für den Abbau von Fragmenten, der in der Regel durch enzymatischen Verdau in der Probe (RNasen) erzeugt wird. Deshalb ist es wichtig, die Nukleinsäure so schnell wie möglich von diesen Enzymen zu isolieren. Bei einem typischen Bindungs-Wasch-Eluier-Spin-Prep-Verfahren kommt es aufgrund mehrerer Zentrifugationsschritte sowie der Bindung und Freisetzung des Biomoleküls an/von einer Membran oder einem Bead/Harz zu einer Scherung der Probe. Die Entfernung dieser Prozessvariablen aus dem Workflow der RNA-Isolierung ermöglicht eine bessere Kontrolle der Qualität der finalen Probenfragmente. Einige nachgeschaltete Anwendungen benötigen diese Kontrolle jedoch nicht, da sie weniger empfindlich auf diesen Abbau reagieren. Kontrollen sind hilfreich, insbesondere bei Proben mit geringerer Ausbeute, und können bei der Fehlersuche unterstützend wirken, wenn nachgeschaltete Prozesse versagen.
• Es gibt viele Chromatographieverfahren, die sich die Unterschiede in den Biomolekülen bei der Trennung zunutze machen, wie z. B. Ionen/Ladung bei Kieselgel. Die "Negativ-Chromatographie" funktioniert durch Größenausschluss, sodass die Produkte mit höherem Molekulargewicht zuerst gesammelt werden können. Wir können die intuitive Gleichsetzung unseres Gebrauchs des Wortes "negativ" und Ladung durchaus verstehen! Proteine, die von den SmartLyse™ Enzymen verdaut werden, fließen langsamer durch die Harzmatrix als die RNA-Moleküle und bleiben nach der Zentrifugation in der Säule. Ein schnell anwendbarer Trick: Wenn diese verdauten Proteinfragmente zusammen mit den anderen Biomolekülen mit geringerem Molekulargewicht gesammelt werden sollen, kann die Säule nach der Aufreinigung mit einer höheren Geschwindigkeit gedreht werden, um die langsamer laufende Fraktion zu sammeln.