Protokoll zur lentiviralen Transduktion

Das folgende Protokoll wurde für das High-Content-Screening in 96-Well-Platten entwickelt.

Materialien

• MISSION^® shRNA Lentivirale transduzierende Partikel
  
• Hexadimethrinbromid (Produkt-Nr. H9268)
  
• MISSION pLKO.1-puro Control Transduzierende Partikel (Produkt-Nr. SHC001V)
  
• MISSION shRNA Non-Target Control Transduzierende Partikel (Produkt-Nr. SHC002V)
  
• MISSION TurboGFP Control Transduzierende Partikel (Produkt-Nr. SHC003V)
  
• Minimum Essential Medium mit 10 % fötalem Kälberserum oder ein für die jeweilige Zelllinie optimiertes Wachstumsmedium
  
• Behandelte Zellkulturplatten mit 96 Wells
  
• Zu transduzierende Säugerzellen

Vorbereitung

Säugerzellen so vorbereiten, dass sie exponentiell wachsen und vor der Transduktion nicht zu mehr als 70-80 % konfluent sind.

Eine Stammlösung aus Hexadimethrinbromid mit 2 mg/ml in Wasser herstellen.

Methode

TAG 1

1,6 x10⁴ Zellen in frischem Medium in die für jedes Konstrukt erforderliche Anzahl von Wells in eine 96-Well-Platte geben. Anzahl der Wells für jedes zu verwendende lentivirale Konstrukt und jede Kontrolle duplizieren oder verdreifachen.
18-20 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5-7 % CO₂ inkubieren.

Hinweis: Die Wachstumsraten von Zellen sind sehr unterschiedlich. Die Anzahl der Zellen so anpassen, dass bei der Transduktion eine Konfluenz von 70 % erreicht wird. Bei der Bestimmung der Plattierungsdichte ist auch die Zeitspanne zu berücksichtigen, in der die Zellen vor der Analyse downstream wachsen müssen.

TAG 2

Medium aus den Wells entnehmen. In jedes Well 110 µl Medium und Hexadimethrinbromid in einer Endkonzentration von 8 µg/ml geben. Die Platte vorsichtig schwenken, um zu mischen.

Hinweis: Hexadimethrinbromid verstärkt die Transduktion der meisten Zelltypen. Einige Zellen, wie z. B. primäre Neuronen, sind empfindlich gegenüber Hexadimethrinbromid. Diesen Zelltypen kein Hexadimethrinbromid zugeben. Wird zum ersten Mal mit einem Zelltyp gearbeitet, ist zur Bestimmung der Zellempfindlichkeit lediglich ein Hexadimethrin Kontroll-Well einzusetzen.

2-15 µl lentivirale Partikel in die entsprechenden Wells geben. Die Platte vorsichtig schwenken, um zu mischen. 18-20 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5-7 % CO₂ inkubieren. Die Zellen dürfen nicht mehr als 4 Stunden inkubiert werden, bevor das Medium mit den lentiviralen Partikeln gewechselt wird. Eine Inkubation über Nacht ist zu vermeiden, wenn die Toxizität der lentiviralen Partikel ein Problem darstellt.

Hinweis: Wenn ein lentivirales Konstrukt zum ersten Mal in eine Zelllinie transduziert wird, soll eine Reihe von Volumina oder MOI getestet werden. 2, 5, 10 und 15 µl lentiviraler Partikel pro 1,6 x 10⁴ Zellen oder MOI von 1, 2 und 5 sind einzusetzen, um die optimale Transduktionseffizienz und den Knockdown für jede Zelllinie zu bestimmen (siehe Anhang). Die Transduktionseffizienz kann mit Hilfe der MISSION TurboGFP Control transduzierenden Partikel vor dem Assay mit shRNA-Konstrukten optimiert werden.

Tabelle 1 Volumen in µl, das abhängig vom Virustiter in jedes Well der 96-Well-Platte gegeben wird. In dieser Tabelle wird von ~70.000 Zellen pro Well ausgegangen. Der lentivirale Titer ist auf dem Analysenzertifikat für jede Viruscharge angegeben.

MOI	Lentiviraler Titer (TU/ml)
	106	107	108
0,5	35	3,5	0,35
1	N/A	7	0,7
2	N/A	14	1,4
5	N/A	35	3,5

TAG 3

Das Medium mit den lentiviralen Partikeln aus den Wells entnehmen. Frisches Medium mit einem Volumen von 120 µl in jedes Well geben.

Hinweis: Bei Zelltypen, die nicht stark an der Platte haften, können 100 µl des Mediums entfernt und durch 100 µl frisches Medium ersetzt werden.

Tag 4 und danach

Das Medium alle 3-4 Tage austauschen, bis die Zellen untersucht werden sollen.

Die Zellen können ausgewählt und jeder Klon kann expandiert werden, um die Expression der shRNA zu testen.

Es kann eine Vielzahl von phänotypischen, enzymatischen oder Genexpressions-Assays durchgeführt werden. Der gewünschte Assay soll vor dem High-Content-Screening mit Negativ- und Positivkontrollen optimiert werden.

Hinweis: Aufgrund der zufälligen Integration des Lentivirus in das Wirtsgenom kann die TurboGFP- oder shRNA-Expression bei verschiedenen Kolonien unterschiedlich stark ausgeprägt sein. Durch das Testen einer Reihe von Kolonien kann der optimale Grad der Expression bestimmt werden.

Anhang

Infektionsmultiplizität (MOI, Multiplicity of Infection): Als Infektionsmultiplizität wird die Anzahl der transduzierenden lentiviralen Partikel pro Zelle bezeichnet. Es wird dringend empfohlen, für jeden neuen Zelltyp, der transduziert werden soll, eine Reihe von MOI zu testen. Dadurch wird die optimale Menge an lentiviralem Überstand bestimmt, die für eine effiziente Transduktion jeder verwendeten Zelllinie benötigt wird.

Für die Berechnung:

(Gesamtzahl der Zellen pro Well) x (Gewünschte MOI) = Benötigte transduzierende Einheiten (TU, Transducing Units) gesamt

(Benötigte TU gesamt) / (Auf dem COA angegebene TU/ml) = ml lentiviraler Partikel, die in jedes Well zu geben sind, gesamt

Literatur

1. Li M, Rossi JJ. 2007. Lentivirus Transduction of Hematopoietic Cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2007(10): https://doi.org/10.1101/pdb.prot4755