血漿蛋白質組學為生物標誌物的發現以及體外診斷的未來帶來了巨大的希望。雖然血漿很容易就能進行分析，但是血漿蛋白質組的研究卻受到其巨大動態範圍（10 個數量級）的基本限制。具有巨大診斷潛力的低豐度蛋白質，往往被高豐度血清蛋白質所掩蓋。為了解決這個問題，我們開發了 ProteoPrep® 20，這是一種以抗體為基礎的樹脂，能夠去除血漿中 97-98% 的總蛋白質。去除這些高豐度蛋白質後，就可以使用 LC-MS 方法來檢測與高豐度蛋白質和肽共存或被高豐度蛋白質和肽掩蓋的蛋白質。絕對定量 (Protein-AQUA™) 是一種目標性的定量蛋白質組學技術，具有強大的功效，並且越來越多地被用於各種定量蛋白質組學研究。透過應用ProteoPrep® 20去除最豐富的蛋白質，我們已經能夠從人體血清中鑒定和絕對定量許多較低豐度的蛋白質。我們相信這有可能提供一種多重目標方法，以發現具有生物或診斷意義的蛋白質。
引言
人體血漿蛋白質體的研究是一個令人非常感興趣的領域，特別是對於鑑定疾病生物標誌物的醫藥潛力而言。許多對藥物有興趣的蛋白質在血漿中出現的濃度很低，因此難以檢測。由於高豐度蛋白質的存在，鑑定潛在的生物標記尤其困難。利用 LC-MS 方法，去除這些高豐度蛋白質，就可以看到與高豐度蛋白質和肽共存的蛋白質，以及被高豐度蛋白質和肽掩蓋的蛋白質。移除高豐度蛋白質後，較高負荷的低豐度血漿蛋白質可在反相柱上分離，從而檢測和定量低拷貝數蛋白質。ProteoPrep® 20血漿免疫去蛋白試劑盒是為了去除8 mL血漿中的20種高豐度蛋白質而開發的。去除這 20 種高豐度蛋白可去除血漿中 97% 以上的蛋白質，並允許分析高出 20 至 50 倍的每種蛋白質，以改善低複本數蛋白質的可視化。透過應用 ProteoPrep® 20 來去除 20 種豐度最高的蛋白質，我們已經能夠從人體血清中鑒定出許多豐度較低的蛋白質並進行絕對定量。
血漿事實
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圖 1.AQUA™ 損耗血漿事實
- 據說 10 種含量最高的蛋白質約佔人體血漿中蛋白質總量的 90%。
- 據說 22 種含量最高的蛋白質約佔人體血漿中蛋白質總量的 99%。
- ProteoPrep® 20血漿免疫去除柱可去除下列20種高豐度血漿/血清蛋白質。這 20 種蛋白質約佔人體血漿蛋白質總量的 97%。
圖 2.血漿蛋白質消耗工作流程
方法
高豐度蛋白質去除
使用ProteoPrep® 20免疫去除法去除血漿中的20種高豐度蛋白質。
使用ProteoPrep® 20免疫去蛋白試劑盒（PROT20）從血漿中去除20種高豐度蛋白。所使用的 3.7-mL 大型原型旋轉柱可去除 100 mL 人體血漿。
胰蛋白酶消化
全血漿和去氫血漿的樣本均以 100 mg 等分。每個樣本在碳酸氫銨緩衝液中稀釋至 0.25 mg/mL。加入乙腈至 9% (v/v) 的最終濃度，使用 ProteoPrep® Reduction/Alkylation Kit (PROTRA) 還原及烷基化每個樣品。加入濃度為 1% (w/w) 的蛋白組學級胰蛋白酶 (T6567)，並在 37 °C 下培養 3 小時。再加入等分的 1%(w/w)胰蛋白酶，然後將樣品在 37 °C 下進一步培養過夜。消化物在 SpeedVac™ 中烘乾完成。
LC-MS/MS分析
使用Agilent毛細管1100 HPLC注入胰蛋白酶消化的 ProteoPrep® 20去除血漿樣品（如方法中所述製備）。使用 15 cm × 2.1 mm Discovery C18 色譜柱，以 3 小時梯度進行反相分離。流動相由甲酸化水和乙腈組成。分離系統與 Thermo Finnigan LTQ 線性離子阱質譜儀耦合，對每個全掃描譜中最豐富的十個離子進行串聯質譜。在獲得相關離子的串聯 MS 結果後，該離子會被加入排除清單，以方便檢測較低豐度的離子。我們開發了一套 LC-SRM 方法，對應蛋白質目標白蛋白 (表意肽 = FQNALLVR) 和凝膠蛋白 (表意肽 =GASQAGAPQGR)，如結果部分所述。
AQUA™分析
將同位素標記的兩種目標多肽（分別為 FQNALLVR* 和 GASQAGAPQGR*）溶於 0.1% TFA 中溶解，最終濃度為 62.5 fmol/mL。每個消化樣品（全血和去氫血漿）均溶解於 20 mL 的 AQUA™ 多肽儲備溶液中。使用 Agilent capillary 1100 HPLC 結合 Thermo Finnigan LTQ 線性離子阱質譜儀分析樣品。使用 LC-SRM 方法測定每種多肽（和相應蛋白質）的絕對量。
Results
圖 3. Protein-AQUA™ 方法概述。此方法由 Steve Gygi 博士及其哈佛醫學院的同事所開發 [Stemmann O., Zou H., Gerber S. A., Gygi S. P., Kirschner M. W.; Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase, Cell 2001, Dec 14, 107: 715-726] 。根據與哈佛醫學院的授權安排，此方法可有限度使用。
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從生物樣品中提取蛋白質，並加入已知數量的 AQUA™多肽。
消化。
用 LC-MS/MS 或 MALDI 分析，定量分析感興趣的蛋白質。
點擊圖片放大。
圖4.用於絕對蛋白質定量的Protein-AQUA™ LC-SRM的開發。使用 Agilent 毛細管 1100 HPLC 連接 Thermo Finnigan 線性離子阱質譜儀，注入經臨床消化的 ProteoPrep® 20 脫離血漿樣品（如方法中所述製備）。基峰色譜圖（圖 2A）顯示出可能或可能未經色譜解析的物種的複雜混合物。利用串聯 MS 的強大功能，我們有把握地從耗竭的血漿樣品中正確識別出 100 多種蛋白質。其中兩個蛋白質（白蛋白和凝膠蛋白）被選作進一步研究。圖 2B Figure 2B 中所示的全掃描 MS 顯示了從其中一個白蛋白肽鑑定出的 481 Da 雙重電荷離子的高豐度。此序列隨後在圖 2C 中以豐度的 y- 和 b- 離子得到證實。這種實驗方法除了提供設計 SRM 實驗的必要資訊外，還為選擇合適的 AQUA™多肽奠定了基礎。如 圖2B 和 圖2C所示，選擇此特定白蛋白肽的雙重母離子進行碎片分析，並選擇串聯 MS 中最豐富的兩個 y 離子進行檢測。
利用ProteoPrep® 20耗竭技術，我們能夠鑑定這些蛋白質並進行絕對定量。使用 Bioworks 3.2 中的 SEQUEST 演算法搜尋資料集。篩選出的蛋白質包括單、雙、三電荷離子的 XCORR 值 1.9、2.2 和 3.75，以及 delta CN > 0.1 和 Rsp > 4。
圖 3.Protein-AQUA™ Analysis of Albumin in Whole Plasma and ProteoPrep® 20 Depleted Samples.選定反應監測 (SRM) 專門針對 MS 檢測產生特定子離子的選定母離子。圖 3A (全血漿) 和圖 3C (去除) 描述內源白蛋白勝肽 FQNALLVR，雙重電荷離子碎片產生兩個豐富的 y 離子。在圖 3B（全血漿）和圖 3D（耗竭）所示的 AQUA™ 多肽標準中，也監測到這些相同的 y 離子；然而，由於加入了穩定的同位素胺基酸，AQUA 尖峰中母離子和子離子的絕對電荷質量都較高。定量的方法是在 34.8 分鐘時，整合此處顯示的共結峰區。樣品的 Protein-AQUA™ 分析顯示使用 ProteoPrep® 20 血漿免疫去白蛋白試劑組可去除 99.8%的白蛋白，與先前獲得的 ELISA 數據非常吻合。
圖 4.Protein-AQUA™ 分析全血浆和 ProteoPrep® 20 贫化样品中的凝胶酶原。SRM 分析內源凝膠素肽 GASQAGAPQGR 在全血漿中會產生複雜的色譜圖（圖 4A），解析度差且信噪比低。在去氫血漿中進行分析時（圖 4C），內源凝膠素肽很容易與干擾物質分離，而且通過與 AQUA™ 肽內標進行比較，很容易計算出其濃度（圖 4B 和 4D）。
參考資料
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