Duolink^® PLA邻位连接技术的应用

Duolink^® PLA邻位连接技术可检测、定量和可视化蛋白互作、翻译后修饰和低丰度蛋白，采用与传统免疫荧光(IF)或免疫组化(IHC)实验相似的易于操作的免疫检测方法，却能生成更灵敏的信号。从下列各种不同应用探索Duolink^® PLA产品的功能多样性。

蛋白质互作
翻译后修饰
低丰度蛋白
蛋白质定位
数字化定量

蛋白质互作

蛋白质互作形成的复合体在许多重要的生物学过程中都发挥着关键作用，包括DNA复制、转录、翻译、剪接、分泌、细胞周期调控、信号传导和中间代谢。蛋白质的功能和活性通常需要与其他蛋白互作来调控。人们探索疾病信号通路的需求推动着蛋白与各种细胞组分互作的研究。不论是对于瞬时的还是稳定的蛋白互作，关键是要能检测到它们。有了Duolink^®技术，您就能可视化稳定、微弱和瞬时的内源性蛋白互作。

蛋白质间的互作可查看STRING数据库。

翻译后修饰

蛋白质互作一般取决于其中一种或两种蛋白的修饰状态。翻译后修饰(PTM)指合成期间的蛋白质在完成核糖体翻译后（通常由酶介导）的共价修饰。用于调节蛋白质组功能和结构的部分PTM类型包括：磷酸化、糖基化、乙酰化、硫酸化和泛素化。一直以来，PTM分析需要借助凝胶电泳、质谱、HPLC和免疫化学等多种技术。而采用Duolink^®技术就能可视化固定细胞和组织中的内源性修饰事件。

更多翻译后修饰内容可访问此页

低丰度蛋白

研究天然形式的蛋白质对于真实的疾病生物学研究至关重要。但是，某些给定样本中的蛋白浓度的动态范围很广。导致传统的天然蛋白研究不得不过表达微量靶蛋白，标记或遗传修饰靶蛋白。而采用Duolink^®技术无需这些操作即可内源性检测单分子级别的蛋白或蛋白互作。

蛋白质定位

蛋白质定位需要计算预测蛋白质在细胞内的具体位置。在亚细胞水平了解蛋白质定位有助于更好地了解蛋白质功能、互作和细胞信号传导通路。采用传统技术虽可研究内源性蛋白质定位，但结果中常常会混入与其他蛋白的非靶标结合和交叉反应。Duolink^®技术则利用二抗系统提高了目标蛋白的检测特异性和灵敏度。

数字化定量

细胞和组织图像均可进行分析。大多数显微镜软件和其他免费软件（如BlobFinder、Image J、Cell Profiler等）均可用来分析PLA数据。通过某些软件提供的细胞核自动检测和细胞质大小估算功能，研究者能够对组织或细胞群中的蛋白质表达水平进行单细胞统计学分析。

流式细胞术

流式细胞术是优异的细胞群分析方法。Duolink^®在 flowPLA流式检测试剂盒凭借对蛋白质、蛋白互作和蛋白修饰的灵敏检测能力，支持更大规模的细胞群分析。Duolink ^®flowPLA实验需要固定处理的悬浮细胞、两种可特异性识别目标蛋白的一抗、一对PLA邻位探针（一个PLUS和一个MINUS）、洗涤缓冲液和Duolink^® flowPLA检测试剂盒。flowPLA试剂盒分4种荧光染料：红色、绿色、橙色或远红。

延长Duolink^® PLA扩增时间有助于流式检测低丰度蛋白靶标。通过Duolink^® PLA实验检测组蛋白甲基转移酶EZH2介导的组蛋白3赖氨酸27的三甲基化(H3K27me3)。A)100分钟扩增后，荧光显微镜只检测到DU145细胞核（蓝色）中的少量PLA信号（红色）。FITC标记鬼笔环肽染色肌动蛋白（绿色）为复染。B)延长扩增时间后，对低丰度蛋白事件（例如EZH2-H3K27me3互作）的流式检测也随之增强。C)结合Duolink® PLA技术与成像流式细胞术可定位更大细胞群中的蛋白或蛋白事件（互作或修饰）。

参考文献

1. Phizicky E, Fields S. 1995. Protein-protein interactions: Methods for detection and analysis. Microbiol Rev. .(59):94-123.

2. Stadler C, Rexhepaj E, Singan VR, Murphy RF, Pepperkok R, Uhlén M, Simpson JC, Lundberg E. 2013. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nat Methods. 10(4):315-323. https://doi.org/10.1038/nmeth.2377