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Auto2D® 裝置 IEF Chip pH3-10 和 IEF Chip pH3-10NL
2. Auto2D® 模式和 Auto2D® Plus 模式有何不同？
Auto2D® Plus 模式是改進的操作模式。它透過施加電壓，主動將蛋白質載入濕凝膠中。與採用傳統電泳方法的 Auto2D® 模式相比，樣品載入效率非常高，運行時間縮短 30 分鐘。由於 Auto2D® Plus 模式可使用較大量的蛋白質，且蛋白質在凝膠中的吸收率較高，因此相較於 Auto2D® 模式，您可以檢測到更多的光點。在 Auto2D® Plus 模式下，有一些新功能可以簡化樣品的製備，包括 Desalt 配方和 Auto-Stain 配方。強烈建議使用 Auto2D® Plus 模式，除非您需要與之前使用 Auto2D® 模式獲得的資料保持一致
3.如何選擇 IEF 晶片？
如果您想全面分析蛋白質，請選擇 IEF 晶片 pH3-10 或 pH3-10NL。如果您想在較窄的 pH 範圍內有較好的解析度，請選擇 pH4-7 或 pH6-10 的 IEF 晶片。如果您想分析特定蛋白，請選擇 pH4-5.5、pH5-6.5 或 pH7-10 的 IEF 芯片。
Auto2D® IEF 晶片選擇
Auto2D® IEF PAGE 晶片選擇
5.我應該使用哪種兩相溶劑？
我們建議使用下列兩相溶劑。
用於 IEF 芯片 pH3-10NL：
- IPG 缓冲液 pH3-10NL（17-6000-88，Cytiva）
用於 IEF 芯片 pH3-10：
- BioLyte® 3/10 100X (1632094, Bio-Rad) *加入 2 µL BioLyte® 至 Rehydration solution。
- 混合 ZOOM™ Carrier Ampholytes pH3-10 (ZM0021, Thermo Fisher Scientific) 與 Pharmalyte® 3-10 (17-0456-01, Cytiva / P1522, Sigma-Aldrich), 比例 1：1
對於 IEF 晶片 pH4-7、pH4-5.5和pH5-6.5：
- IPG 缓冲液 pH4-7 (17-6000-86, Cytiva)
- 载体两性溶解物 pH4-7 (ZM0022, Thermo Fisher Scientific)
对于 IEF 芯片 pH6-10 和 pH7-10：
- IPG 緩衝液 pH6-11 (17-6001-78, Cytiva)
6.適當的樣品量是多少？
樣品量取決於檢測方法。建議的樣品量如下：
- CBB 染色：25 µg 或以上
- 螢光染色：25 µg 或以下
- 銀染色：10 µg 或以下
- 螢光預標記：3 µg 或更少
7.Auto2D® 裝置可以使用何種標籤染料？
樣品可以在電泳前使用螢光染料試劑預先標籤。在 2-D 電泳中，必須使用不會影響蛋白質等電點（總電荷）的染料。行之有效的方法包括以下幾種：
- 使用含有 NHS-ester 的試劑標示伯胺（N-端，Lys）
- 例如：Cy2/Cy3/Cy5 最小標示染料 (Cytiva)、IC3/5-OSu 特殊包裝 (Dojindo) 或 Cyanine 3/5 NHS 聚酯 (Abcam)
- 使用含馬來酰亞胺的試劑標示巯基 (-SH，S-S)
- 例如：Cy2/Cy3/Cy5 飽和標示染料 (Cytiva)
8.樣品中的去垢劑如何影響二維凝膠電泳 (2DE)？
這取決於去垢劑的類型和濃度。不能使用極性強的離子去垢劑。例如，如果樣品含有 SDS，請適當稀釋或使用 2-D Clean-Up Kit 將其去除。在某些情況下，可以使用非離子（不帶電荷）洗滌劑，例如 DDM。如果可能的話，請使用 CHAPS，這與 Rehydration Solution 中包含的相同。
9.您建議用什麼方法來純化或脫鹽樣本呢？
我們通常使用 2D Clean Up Kit 和 Zeba™ desalt spin columns 來製備樣本。我們建議低濃度樣品使用 2D Clean-Up 套件，以確保最大的樣品保留率。Zeba™ desalt 旋轉柱比 2D Clean Up 套件更快，我們建議濃度足夠的樣品使用，因為在濃縮過程中會有輕微的樣品流失。
10.如何使用免疫沉淀法製備樣品？如何使用免疫沉澱法 (IP) 準備樣品？
使用 IP 準備樣品時，我們建議如下：
- 如果您不重複使用抗體進行 IP，我們建議使用 Rehydration Solution 洗離樣品。
- 如果您用其他緩衝液洗脱樣品，在應用於 Auto2D® 裝置之前，請用 2D Clean Up 套件和 Zeba™ desalt spin column 將緩衝液與 Rehydration Solution 交換。
11.我該如何解讀電壓和電流的圖表？
您可以利用每張圖表作為成功 2DE 的指標，並改善樣品製備。200V 的電流峰來自帶電的小分子，例如鹽。約 1000V 的電流峰來自帶電的中型分子，例如脂質和縮氨酸。高壓步驟的電流峰則來自帶電的較大分子，例如蛋白質和核酸。如果 IEF 過程最後一步的電流穩定在 50 µA 以下，就有可能成功分離。在 IEF 中，由於樣本蛋白質已聚焦在其個別等電點上，因此電流值會逐漸降低並穩定下來。
Auto2D® 裝置電壓和電流圖
Auto2D® 裝置烷基化半胱氨酸
4. 將其儲存為新配方。
13.我可以在非還原環境中進行二維分析嗎？
您可以在非還原環境中進行二維分析，方法是製備不含 DTT 的工作復水溶液和或平衡緩衝液。如果您在非還原環境下進行二維，我們建議使用含尿素的Equilibration Buffer。
含尿素的Equilibration Buffer：7.5M Urea, 20w/v% Glycerol, 125 mM Tris HCl pH6.8, 5w/v% SDS, 0.01w/v% BPB
14.我可以在原生環境下進行 2DE 嗎？
您可以在原生環境下進行 2DE，例如 "Native-IEF x SDS-PAGE" 或 "Native-IEF x Native-PAGE"，只要更換試劑即可。但是，Native-PAGE 無法分離基本蛋白。
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