在病毒載體製造過程中使用切向流過濾
病毒載體的生產是基因治療和疫苗製造的關鍵步驟。成功與否取決於使用正確的技術來確保製程的最佳化、高效率和可預測性。在病毒載體的下游處理中使用的一項重要技術是切向流過濾 (TFF)。
在病毒載體製造過程中，TFF 步驟有兩個重要用途：
- 在捕獲層析步驟之前減少容量和重過濾
- 在最終無菌過濾之前最終濃縮和交換到制劑緩衝液
最終，TFF 可確保病毒載體達到目標濃度，而且最終產品在所需的藥物基質或緩衝液中。
開發和優化下游處理中的 TFF 步驟需要考慮幾個因素。
為病毒載體製造設計 TFF 步驟時的最佳實務
設計 TFF 步驟時，首先要確定目標。設計 TFF 步驟首先要確定目標，無論是要達到目標產品濃度以消除某些下游製程瓶頸，或是要將製劑轉移至特定緩衝液，然後在純化製程結束時濃縮。選擇可擴展的系統設計和裝置形式至關重要；此外，還需要對系統的規模性能進行表徵，並採用適當的縮減率，以便在全規模下達到所需的產量和能力。
使用封閉式處理時的一個重要考慮因素是，系統和裝置應針對這種方法進行設計。
還應該知道目標分子的大小和等電點，以及溫度、剪切力和混合等關鍵製程變量對模態穩定性的影響。此外，還應該知道該模式與結構材料的互動方式，無論膜是以聚醚砜 (PES) 為主，還是以再生纖維素為主。一般而言，再生纖維素是需要低分子結合的應用的首選；然而，膜的類型及其與模式的互動需要經過實驗驗證。
有不同类型的膜和过滤器格式可用于 TFF。一般推薦用於病毒載體生產的膜是由 PES 或再生纖維素製成的，其分子量截止值為 30、100 或 300 kDa。
中空纖維傳統上用於工業和生物醫學分離，現在已被許多生物製藥應用採用。它們有改性 PES 和混合纖維素酯內腔可供選擇。中空纖維過濾器可根據管腔數量、直徑和長度來選擇。平片濾盒可搭配改性 PES 和再生纖維素膜，專為生物製藥應用而設計。它們非常堅固耐用，以緊湊的形式提供高效的製程性能和線性可擴展性。
圖 1.首創的螺旋式纏繞 Pellicon® Capsule 膠囊設計，以隨插即用的方式提供高效能與線性擴充能力，特別適合用於病毒載體的生產。膜孔尺寸包括 100 kDA 和 300 kDa。
TFF 操作控制策略和病毒載體製程開發的可擴展性
滲透控制 TFF 系統通常用於微過濾（MF）應用，在這些應用中，高滲透性膜可能會導致過高的流量，從而降低性能或使性能不穩定。對於更嚴格的超濾 (UF) 膜應用，例如 30 kDa 的抗體保留，跨膜壓力 (TMP) 控制系統可作為替代。相反，通常用於病毒載體製造的膜截止值為 100 和 300 kDa，如腺相關病毒 (AAV) 和慢病毒 (LV)。
一項研究評估了病毒載體製造工作流程中澄清後/擷取前 TFF 步驟中的 TMP 和滲透物控制策略。Pellicon®膠囊被用於實驗中。
實驗中使用的是縮小的 Pellicon® XL 50 膠盒和 100 和 300 kDa Ultracel® 膜。
在 TMP 控制操作中，使用進料泵，滲透物自由流動（圖 1）。在滲透控制操作中，使用了雙泵 TFF 系統，其中包括一個進料泵和一個滲透泵，以限制和控制滲透物的流動。
圖 2.本研究中使用的 TFF 系統示意圖：TMP 控制 (a) 和滲透泵滲透控制 (b)。
進行了初步實驗，以確定兩種控制策略下 TFF 過濾器的滲透通量。之後，進行了超濾/反過濾（UF/DF）過程模擬，以評估平均通量、處理時間、TMP、病毒產率和雜質減量（表 1）。製程模擬的目標是在批次模式下濃縮四倍 (4x)，用五個二倍容積 (5 DV) 的 HEPES 緩衝液在恆定容積下重複過濾，然後在批次模式下濃縮二倍半 (2.5x)，使總體容積濃縮因子 (VCF) 達到 10x。
完整的方法和實驗結果請參閱應用說明，標題為：Evaluation of TFF Operating Control Strategies and Scalability for Viral Vector Process Development
。TFF 控制策略的比較
TMP 控制系統相對簡單，使用者只需設定進料流量和回流閥，即可得到目標 TMP。當操作點設定在高原附近時，UF/DF 過程中每一點的通量都會接近最大值，隨著濃度的增加而自然降低。由於平均流量較高，這種方法可提供最短的製程時間。
滲透控制系統可限制滲透流量，使其遠低於 TMP 控制系統的最小流量，並減少膜上的極化，從而改善性能，例如雜質減少。然而，滲透控制系統需要 TMP 控制系統（滲透泵或控制閥）以外的額外控制元件，並可能導致臨界通量時 TMP 呈指數上升，有可能因進料壓力或 TMP 限制而無法完成運行。
在這項研究中，根據 300 kDa 膜與 Pellicon® Capsule 及 Pellicon® XL 50 cassette 的比較，TMP 控制操作顯示出高達兩倍的流量（或時間）優勢，可將所需的膜面積減少一半。滲透控制操作顯示出更高的雜質去除優勢。病毒產量的結果參差不齊。使用兩種控制策略時，AAV2 的產量相近，但在噬菌體的滲透控制模式研究中，產量普遍較高。
在 Pellicon® 膠囊和膠盒系列中的擴展
透過比較通量、TMP 剖面、產量以及使用病毒模型飼料和 AAV2 減少雜質，證明了膠囊和膠盒的擴展。Pellicon® TFF 過濾器系列可在廣泛的飼料批次大小範圍內實現線性擴展。表 2展示了一個例子，說明如何使用單次使用的 Pellicon® Capsules 處理最大 2,000 升的 TFF 批次。如果需要擴展到更大的多用途批次，可以無縫切換到具有相同膜和篩網組合的 Pellicon®2 膠囊。
Pellicon® Capsules and Hollow Fibers Comparison of Pellicon® Capsules and Hollow Fibers for TFF in Viral Gene Therapy Manufacturing
以下研究評估了使用病毒模型飼料進行 TFF1 步驟時的過濾器性能。本研究評估了 Pellicon® Capsules 及其減縮過濾器 Pellicon® XL 50 cassettes，並與兩種中空纖維模組 HF-A (0.5 mm/60 cm) 和 HF-B (0.5 mm/20 cm) 的性能進行了比較。
整套方法和實驗結果可在標題為 "Pellicon®"的應用筆記中找到：Pellicon® Capsules versus Hollow Fibers for Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) in Viral Gene Therapy Manufacturing
尺寸方案和製程影響分析
HF-B（0.5 mm/20 cm）在性能方面的優勢。/h3>
使用 Pellicon® Capsule 和中空纖維，將 300 kDa 滲透控制製程模擬結果應用於建立兩種理論尺寸方案：
- 方案 1 假設所有過濾器使用相同的負載。此方案比較了在 35 L/m2 負荷下 100 L 批次的運行時間和可能的最大 VCF。
- 方案 2 限制了完成 TFF 過程所需的時間。此方案比較在 4 小時內處理 1000 L 批次所需的過濾面積和可能的最大 VCF，這需要可變的加料。
方案 1 的結果顯示在 表 3中。當使用相同的負載 (35 L/m2) 時，在相同的歸一化交叉流率下，Pellicon® Capsule 的運行速度比中空纖維 HF-A 快 2.9 倍。即使中空纖維 HF-B 使用三倍於膠囊的橫流速率，膠囊的速度仍快 1.7 倍。雖然與 HF-A 相比，HF-B 能夠節省一些時間，但較高的交叉流率使中空纖維系統的最大可能 VCF 降低了 ~4 倍。
方案 2 的結果如表 4所示。為了獲得相同的製程時間（4 小時），當過濾器以相同的交叉流率運作時，Pellicon® Capsule 只需要中空纖維模組 35% 的過濾面積和 37% 的進料流量 - 即與 HF-A 情況相比。如果將中空纖維的交叉流率提高三倍以增加其通量（HF-B 情形），則膠囊只需要中空纖維過濾面積的 58% 及其進料流量的 21%。還應注意的是，中空纖維系統較高的進料流量降低了最大可能的 VCF ~4x.
。總體而言，研究結果顯示中空纖維模組在給定剪切力下的通量較低，因此與 Pellicon® Capsules 相比，需要更高的膜面積或處理時間。雖然中空纖維的交叉流率增加以達到更高的生產率，但通量仍低於 Pellicon® Capsules，因此所產生的系統在達到高濃度目標時可能會受到限制。
相較之下，Pellicon® Capsules 比中空纖維能達到更高且更穩定的通量，因此 TFF 製程更有效率，同時病毒產量也相當。所產生的系統體積也更小，因此能達到更高的濃度目標。
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