內毒素是細菌衍生的疏水性脂多醣 (LPS) 小分子，很容易污染實驗室用具，其存在會嚴重影響 體外 和 體內 實驗。內毒素可透過濾泡卵母細胞裂解液（LAL 分析）檢測出來，其檢測結果可低至 0.01 內毒素單位 (EU)/mL。內毒素的大小約為 10 kDa，但容易形成高達 1,000 kDa 的大型聚集體。細菌在細胞死亡時，以及在生長和分裂活躍時，會大量排出內毒素。每個大腸桿菌含有約 200 萬個 LPS 分子。內毒素具有很高的熱穩定性，因此在一般的消毒條件下無法破壞。它們是兩面性分子，在溶液中帶有淨負電荷。由於它們具有疏水性，因此很可能與其他疏水性材料（如實驗室中使用的塑膠產品）有很強的親合力。因此，實驗室的燒杯、攪拌棒和其他實驗用具經常會造成攜帶性污染。
Figure 1.Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.
內毒素與外毒素有何差異？
兩者對細胞培養都有潛在的危害。外毒素是由細菌分泌並釋放到細胞外的有毒物質，通常是蛋白質。而內毒素是由位於細菌細胞壁內的脂質組成的細菌毒素。外毒素通常會被高溫破壞，而內毒素則無法被高溫破壞。外毒素具有高抗原性，可引起免疫反應，而內毒素則不會。
如何測試內毒素？
陰性灰質細胞裂解液分析法（LAL 分析法）是最常用的內毒素測試方法。LAL（取自鲎）與細菌內毒素脂多醣（LPS）產生反應，脂多醣是革蘭氏陰性細菌的膜成分，會形成凝膠凝塊，並可進行量化。內毒素以每毫升內毒素單位 (EU/mL) 量測。一個 EU 約等於 0.1 至 0.2 ng 內毒素/毫升溶液。目前 LAL 分析法有三種形式，各有不同的靈敏度。LAL 凝膠凝塊檢測法可檢測到 0.03 EU/mL，而 LAL 動力比浊法和顯色法可檢測到 0.01 EU/mL。
Figure 2.LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.
實驗室中常見的內毒素污染源有哪些？
要大幅降低細胞培養實驗室的內毒素含量，必須徹底潔淨所有實驗用具、培養基原料和正確的實驗技術。此外，還建議使用過濾裝置（如 Stericup® 過濾器）過濾消毒所有培養基，這樣可以在引入細胞前消除所有潛在的內毒素。
- 水：高純度的水對每個實驗室來說都是不可或缺的。Milli-Q® Integral 是一套水純化系統，可直接從自來水中為實驗室提供超純無內毒素的水。該系統每天可產生高達 300 公升的純水和/或超純水，可滿足大多數實驗室的需求。此外，我們還為所有細胞培養應用提供一次性使用的瓶裝 血清：由於其生物動物來源，胎牛血清一直是攜帶內毒素的罪魁禍首。然而，經過改良的篩檢方法已大幅降低風險。
- 細胞培養試劑：常見的試劑如 Ecoli. 衍生的重組生長因子、荷爾蒙、脂質、基底培養基和解離試劑如胰蛋白酶都可能是內毒素的來源。我們會檢測所有經測試的細胞培養試劑的內毒素含量。
- 塑料/玻璃器皿：玻璃器皿、塑膠管和配件應不含熱原，可重複使用的器皿應使用不含熱原或低內毒素的水沖洗。塑料瓶應使用伽馬輻照消毒：細菌存在於皮膚、頭髮和唾液的所有表面。因此，在處理細胞培養物時，必須使用正確的無菌技術，以盡量降低將內毒素引入系統的風險。
內毒素對細胞培養有什麼影響？
內毒素同時影響 體外 和 體內 細胞的生長和功能，並且是顯著變化的來源。 在體外，越來越多證據顯示內毒素會造成細胞培養研究的各種問題。所記錄的影響包括刺激白細胞培養物製造組織因子、誘導馬巨 噬細胞製造 IL-6，以及極低水平 (低於 1 ng/mL)的內毒素抑制小鼠紅細胞集落的形成。 在體內，內毒素在動物研究中會引起發炎反應。注射產品（疫苗和注射藥物）中的內毒素可導致從發燒和發冷到不可逆轉的致命敗血性休克的熱原反應。
細胞培養物中可接受的內毒素限度是多少？
鑑於內毒素污染的嚴重風險，美國食品藥物管理局 (FDA) 已設定研究人員應注意的醫療器材和腸外用藥的內毒素濃度限制。目前 FDA 的限制要求來自醫療裝置的洗出液必須低於 0.5 EU/mL，除非該裝置接觸到腦脊液，此時的限制為 0.06 EU/mL。
如何預防內毒素污染？
使用可信賴的試劑供應商提供的經內毒素測試的試劑、補充劑和培養基是非常重要的。同樣重要的是，在培養細胞前，要使用正確的無菌技術，徹底沖洗和消毒所有細胞培養塑料器皿和消耗品，如移液管和錐形管。
如果培養物受到污染，如何清除內毒素？
如果培養物受到內毒素污染，建議丟棄所有試劑和細胞，並從新試劑和細胞開始培養。但是，如果樣本無法丟棄，可以使用試劑來消除它們。這些 內毒素去除溶液 依靠 Triton X-114 的膠束特性去除樣品中的 LPS 內毒素。
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