用於診斷的納米金顆粒
Alexandra R. Fernandes1, Pedro V. Baptista1
1UCIBIO, Dept. of Life Sciences, FCT-NOVA, Campus Caparica, 2829-516 Caparica
引言
奈米醫學的研究推進了許多生物醫學工具和奈米材料的應用，主要集中在新的診斷平台和治療策略。雖然藥物傳輸是這些年來最先被更徹底檢驗和發展的領域，但對奈米材料特性更深入的了解，讓我們得以設計創新的診斷策略。奈米材料的獨特特性，加上對操作和組裝的嚴格控制能力不斷增強，進一步推動了將診斷和傳輸結合到一個裝置中的概念，使其成為精確治療的重要資產。因此，奈米醫學可被視為分子醫學的改良，結合基因組學與蛋白質組學的創新，提供更個人化的醫療，從早期診斷到精準治療，允許精確描述病患的分子特徵，在改善療效的同時，將病患的風險降至最低。1-2
這些奈米結構已在生物醫學領域中找到了廣泛的應用，特別是在診斷方面，例如檢測和識別代謝物、蛋白質和核酸 (DNA 和 RNA)。也許影響最顯著的是分子診斷，奈米材料的使用促使生物檢測和分析方法的範式改變。在此框架內，以奈米粒子為基礎的診斷技術提供了前所未有的靈敏度。由於大多數生物標誌物的尺寸範圍與這些奈米級結構相似，因此可提供 1:1 的比例回應；靈敏度的提升也允許使用較少的樣品，因此可減少分析程序對堅固儀器的需求，進而提高可攜性，將概念實驗室帶到需求點 (病患床邊、臨床醫師的實驗室等)。
金奈米粒子的合成與功能化
用於蛋白質檢測的大多數平台通常依賴使用抗原和抗體的分子識別，而用於核酸感應的平台則依賴核苷酸序列的互補性，通過雜交協議進行。目前，相關核苷酸序列生物標誌物的生物檢測已逐步整合了奈米粒子系統，以提高靈敏度並降低成本。3
AuNPs 的主要特徵是其局部表面等離子體共振 (LSPR)，這也是其顯著光學特性的原因。LSPR 可定義為電子在空的軌道之間對入射電磁波所產生的集體振盪，這會在奈米粒子中產生極化，誘發偶極矩的形成。LSPR 與奈米粒子的大小、形狀、成分、奈米粒子之間的距離，以及它們與周圍電介質的互動關係有很大的關係。此現象導致 AuNPs 的膠體懸浮液產生不同的顏色，從深淺不一的紅色到藍色和紫色。因此，嚴格控制 AuNP 尺寸對於調整光學特性以達到所需的生物檢測波長至關重要。此外，為了充分利用這些光學特性，可以採用不同的合成路徑、溶液分散方法以及表面功能化策略。3,4
合成 AuNPs 最常見且最直接的方法是透過化學還原金鹽，通常是三水四氯金酸 (HAuCl4。3H2O），在還原劑（如硼氫化鈉、抗壞血酸或檸檬酸鈉）的存在下，這些還原劑與顆粒表面結合，提供了穩定性、反應性和特定電荷特性。舉例來說，檸檬酸鈉自 1951 年起就被用來生產尺寸範圍從 1 到 150 nm 的單分散奈米微粒。5 雖然金屬離子的化學還原是合成金屬奈米微粒最普遍的方法，但其中有些還原劑有毒、昂貴，而且其殘餘物會納入奈米結構中，使表征變得困難，並限制了 in vivo 的應用。此外，pH 值和溫度等製程變數的控制對於獲得均勻的粒度分散是非常重要的。6由於檸檬酸鹽還原法既簡單又能合理控制粒度分散和形狀，因此由 Turkevich 提出，後來由 Frens 加以優化，成為製造 AuNPs 用於生物醫學應用最普遍的方法。3,5,7,8只要改變還原劑 (例如、檸檬酸鈉），就可以在合理控制尺寸的情況下擴大生產規模 (圖 1)。例如，當使用較低濃度的檸檬酸鈉時，所產生的顆粒直徑較大，因此結塊的數量也較多。事實上，此製程對於較小的奈米粒子（直徑 10-30 nm）會產生較好的結果，而較小的奈米粒子也較為穩定，因此較不容易結塊 並在生物檢測中提供更好、更可重複的結果。膠體 AuNPs 溶液的穩定性取決於其與周圍介質的互動，可透過靜電穩定（離子互動，其中奈米顆粒因表面存在帶電分子而互相排斥）或由共價互動介導的靜電穩定，以防止其他 AuNPs 接近。與離子互動相比，共價互動提供了一些優勢，經修飾的 AuNPs (例如、6,8
減少 AuNPs 聚團趨勢的一種方法是使用表面活躍劑、聚電解質或配體對納米粒子表面進行修飾。這不僅能改善膠體的穩定性，還能讓 AuNPs 衍生出大量適合生物辨識的生物分子，例如抗體和 DNA/RNA 寡聚體。然而，功能化製程的品質仍會直接受到基底粗糙度、與表面接觸的時間、溶劑濃度以及介質溫度等因素的影響。此外，共結層的形貌忠實地再現了 AuNP 的表面，因此也再現了其表面缺陷。在金表面發現的主要缺陷類型之一是單原子空位，也就是表面呈現不規則現象，例如金原子的減少，直接影響功能化的形成、組織和效率。
圖 1.枸櫞酸還原法合成的AuNPs的表徵。AuNPs 的表徵使用了幾種標準且直接的技術，例如A)透射電子顯微鏡 (TEM)，顯示出球形且具有良好的尺寸分散性；B)紫外可見光光譜，其中 LSPR 峰用於評估尺寸和穩定性；C)動態光散射 (DLS)，可測量 AuNPs 的流體動力半徑，從而突顯尺寸分散性；D)zeta 電位，可提供 AuNPs 表面電荷的資訊，從而評估穩定性。總而言之，這些資料都很容易取得，並能提供足夠的資訊進行製造表征。
一般而言，在 AuNP 的表面官能化過程中，所謂的烷硫醇會被用於化學穩定性和易於形成自組單層。6,8 穩定劑的選擇對於診斷應用是非常重要的；這個介面通常會被用來作為生物辨識元件 (例如：DNA、RNA、ptamam) 的連結劑、DNA, RNA, aptamer, peptides, antibodies）的連結劑，在識別目標分析物質時，不應該擾亂用於信號轉換的本質奈米特性。AuNPs 的穩定性也可透過多功能聚合物來控制，這些聚合物具有結合金表面的能力，並可同時與辨識元件 (如甲基、氨基、羧基、羰基、羥基，甚至巯基) 進行結合。或許最常用的連結劑是那些依靠（至少）一個硫醇反應基團的連結劑，由於金原子與硫之間的強烈互動，硫醇反應基團會強烈且自發地與金結合。10,11
抗體是屬於免疫球蛋白類的糖蛋白，通常與生物對外來抗原的防禦有關。抗體可與各種表面結合，並已被用作生物偵測的生物辨識分子，尤其是與 AuNPs 相關的分子。抗體具有高度的親和力和特異性，具有檢測、辨識和結合目標抗原的能力。12 抗原的表位與其抗體之間的結合原理涉及到它們之間的互補性，並透過靜電相互作用、氫鍵、疏水和范德瓦耳斯相互作用形成可逆轉的結合。由於抗體直接官能化到 AuNPs 的表面不像 DNA/RNA 那麼直接，使用異官能聚合物如 PEG (HS-PEG-NH2) 提供了一個奈米粒子官能化的途徑，透過 -SH 基團形成共價鍵，而 NH2 基團則可透過游離 COO- 基團結合抗體。官能化通常是透過使用偶聯劑，例如 1-乙基-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺 (EDC)，事先活化抗體的多個 COOH 基團之一來達成。10
AuNPs用於分子診斷
已有人提出數種基於AuNPs的比色方法，用於檢測生物分子（即、3,13這些方法大多數依賴 AuNPs 溶液在聚集時的比色變化，這個過程可能是由介質電介質的變化或與指定目標的互動所促成。在前者中，目標物的結合和吸附調節了介質介電質的變化對 AuNPs 的影響；後者則依賴於目標物介導粒子間互動的能力，它可以促進 AuNPs 的交聯或通過固態阻礙使它們分離。由此產生的聚集會導致 LSPR 頻帶的移動，此移動可由肉眼感知或透過標準分光光度法測量。幾種基於雜交的 方案就是這種情況，ssDNA探針被官能化到AuNPs上，並以序列依賴的方式用於識別DNA/RNA目標（圖2）。
圖 2.用於分子診斷的金奈米粒子 (AuNPs)。AuNPs 可用於大量基於抗體抗原辨識或 DNA 杂交的診斷方案，例如基於粒子間距離的比色分析；螢光體與 AuNP 表面間距離函數的螢光調變；表面增強拉曼光譜法 (SERS)；以及 AuNPs 作為標記在橫向流平臺 (LFA) 中的應用，以達到需求點的目的。
AuNPs 的電漿特異性和尖銳的電移也可用於根據光散射來檢測生物標記。這些方法依賴於較大且各向異性的 AuNPs 的強烈散射，其光譜變化與結合或與分子結合有關。14
AuNPs也可用於電化學檢測，即將酵素結合到電極上，並作為氧化還原催化劑介導電化學反應。15此外，AuNPs 是眾所周知的螢光染料淬滅劑，這些螢光染料的位置接近其表面，此特性已廣泛應用於分子偵測方案。在這些平台中，與特定目標物質結合會引發識別分子的構象改變，使螢光染料遠離 AuNP 或更靠近表面，進而增加或減少螢光發射。16
拉曼光譜法也從 AuNPs 的使用中獲益良多，尤其是各向異性和不規則形狀的結構。表面增強拉曼光譜法 (Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS) 可大幅增強生物標誌物本質上較弱的拉曼信號強度的金屬表面關聯性。舉例來說，非球形的 AuNPs，奈米粒子的 邊緣作為一個熱點，可使 SERS 信號增強高達 1012 到 1014，為生物標記物的多重檢測提供了一個新的層面。17
側面流設備的案例
側面流設備 (LFA) 是一種便攜式裝置，能夠透過其毛細管作用傳輸生物液體，例如血液或血清，而不需要外部電源供應。LFA 處理快速、直接、成本低、特異性可接受，且無需冷藏。有幾種診斷方法主要是將 AuNPs 納入為探針的標籤/標記，增加系統的靈敏度。3,18,19LFAs的主要機制是樣品內的生物標記物透過毛細管遷移至第一個識別元件與AuNPs結合的區域，通常是擷取ssDNA寡聚體探針或抗原/抗體。然後，此複合物會透過疏水性硝酸纖維素膜或醋酸纖維素遷移至偵測區域，並被第二個識別/擷取元件固定。在裝置的控制部分，第二個擷取/辨識元件會固定初始複合物，但不會固定感興趣的複合物，進而得到結果。AuNPs 的鮮紅色澤使其成為這些系統的理想標籤，適合肉眼評估。3
法規和標準
使用奈米材料和 AuNPs 進行體外診斷的概念性裝置和平台越來越多，因此需要建立標準化的方法和法規規範，以製造和表征奈米材料。20 然而，全球監管機構監管這些產品的能力受到納米材料的性質和規模的限制。納米技術特性實驗室（Nanotechnology Characterization Laboratory，NCL）已經開展了一項這樣的規管工作，這是三個美國聯邦機構之間的正式科學互動：美國國家癌症研究所 (NCI)、食品藥物管理局 (FDA) 以及美國國家標準與技術研究所 (NIST)，為了支援日益增長的特性化與標準化需求而創建。建議的準則和協議涵蓋物理化學特性（即尺寸、形態、形狀、表面電荷等）、體外特性（即無菌性、藥物釋放、靶向性、毒性等）和體內特性（即、
國際標準化組織 (ISO) 已經實施了一些指導方針和認證，例如適用於納米材料工程風險管理的 ISO/TS 12901: 2012；納米材料分類的 ISO/TR 11360: 2010；氣溶膠產生的 NOAAs 定量的 ISO/TS 12025: 2012；以及包含納米尺度零件材料測試指導方針的 ISO/TS 16195: 2013。所有的準則和認證都必須符合更廣泛的指令，以規範體外診斷 (IVD) 的生產和商業化 (1998 年 10 月 27 日歐洲議會和歐洲理事會關於體外診斷醫療裝置的指令 98/79/EC)。
前景和挑戰
儘管在使用 AuNPs 進行分子診斷方面取得了重大進展，但仍有許多問題有待研究，包括提高建議系統的穩健性和可重複性。最大的挑戰或許是如何擴大最具創新概念的生產規模，並將其轉化為臨床應用。對於每一批製成的奈米粒子的控制與特性，以及後續的功能化，都需要依據現行的法規準則進行仔細評估，並需要適當的方法來進行所需的品質控制。為了讓所有這些基於 AuNPs 的創新系統進入體外診斷市場，它們必須遵守與現有 ISO 證書和指南相關的新興標準和法規，以影響和改變我們進行診斷的方式。
鳴謝
作者感謝 FCT/MCTES 對 UCIBIO 的資助（UIDB/04378/2020）。我們也感謝 Catarina Roma-Rodrigues 的圖形支援。
參考資料
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？