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首頁核酸標籤與檢測地高辛 (DIG) 標籤方法

地高辛 (DIG) 標籤方法

Digoxigenin（DIG）標記和抗 DIG 抗體

DIG 系統是標記和檢測核酸的非放射性技術，適用於多種應用。該系統是基於一種從洋地黄植物（Digitalis purpurea 和 Digitalis lanata）中分離出來的類固醇。這些植物是地高辛的唯一天然來源，因此抗地高辛抗體不會與其他生物材料結合，確保了特異性標記。由於具有高度的特異性，與放射性標記相比，DIG 系統所需的材料更少，是核雜交分析的理想選擇。固定化的核酸與 DIG 標記的探針雜交，接著使用高親和力抗體抗 Digoxigenin 抗體進行檢測，抗體可與鹼性磷酸酶 (AP)、辣根過氧化酶 (HRP)、螢光素或羅達明結合，進行比色、化學發光或螢光檢測。

檢測 DIG 標記核酸的範例

圖 1.使用化學發光底物檢測 DIG 標記核酸的實例。

檢測 DIG 標記核酸的範例

透過 PCR 進行 DIG DNA 標籤

當模板的數量有限、已部分純化或非常短時，PCR 標籤是製備 DIG 標籤探針的首選方法。與其他方法相比，它所需的優化較少，並且能產生高產量的標記探針。在 PCR 標籤法中，恒溫聚合酶在擴增模板 DNA 的特定區域時會加入 DIG-dUTP。

反應原理

在標準的 PCR 反應中，Digoxigenin-11-dUTP 會併入新合成的 DNA 中。唯一的先決條件是需要一些目標序列的序列資訊，以便合成適當的引物。非放射性 DIG 系統使用地高甙元（一種類固醇合物）來標記 DNA、RNA 或寡核苷酸進行雜交，並隨後進行顏色或發光檢測。地高辛透過鹼性可標籤酯鍵與 dUTP 結合。經標記的 dUTP 可利用 DNA 聚合酶的酵素核酸合成法輕易結合。將非放射性標籤與 PCR 結合，是分析 PCR 產物的強大工具，也可從少量各自的目標序列中製備標籤探針。

標籤方法DIG-標籤 試劑 其他標籤 試劑
用於標籤的套件 
不含酵素之標籤混合物

  
用於 標籤的核苷酸
酵素

DIG DNA 標記的 PCR 特點和優點

PCR 條件

  • 在嘗試納入 DIG 之前，先在沒有 DIGdUTP 的情況下優化每個模板和引物組的 PCR 擴增參數（循環條件、模板濃度、引物序列和引物濃度）。

模板

  • 為達到最佳效果，請使用克隆插入物作為模板。基因組 DNA 可能較難使用。
  • 模板濃度是成功製作特定探針的關鍵。

標籤

PCR DIG 探針合成試劑盒。DIG探針合成套件 與大多數標籤方法相比，需要較少的優化，因為它包含 Expand 高保真混合酶。這種混合酶的優點包括：

  • 可以有效地使用富含 GC 的區域作為模板
  • 對於大多數模板，不需要優化 MgCl2 濃度，標籤反應可以在標準濃度為 1.5 mM MgCl2

DIG 隨機引物 DNA 標籤

對於大多數模板，不需要優化 MgCl2 濃度，標籤反應可以在標準濃度 1./h2>

隨機引物標示 DNA 的方法是將所有可能的六核苷酸混合物與 DNA 模板雜交。所有序列組合都會在六核苷酸引物混合物中出現，這會導致引物以統計方式與模板 DNA 結合。因此，可確保在模板 DNA 的整個長度上都有相同程度的標記。互補鏈是由隨機六核苷酸引物的 3´ OH 端使用標籤級的 Klenow 酵素合成。反應中存在的經修飾的脫氧核苷三磷酸（[32P]-、[35S]-、[3H]-、[125I]-、digoxigenin 或生物素標示）會被整合到新合成的互補 DNA 鏈中。

這些標示探針特別適用於基因組 Southern 印跡、重組文庫篩選、點/槽印跡和 Northern 印跡上的單拷貝基因檢測。由於每個引物都有不同的六個基元序列，因此標示探針的產品會是長度可變的片段集合。因此，標記探針在凝膠上會呈現斑點狀，而非獨特的帶狀。標記探針的大小分佈取決於原始模板的長度。

標籤方法DIG-標籤
試劑		其他標籤
試劑
DIG High Prime 標籤和檢測入門套件 I
  • DIG High Prime 標籤和檢測入門套件 II<
  • DIG DNA 標籤和檢測套件
    		•  
    標籤檢測試劑盒
    標籤混合物
    用於
    標記的核苷酸
    酵素
    其他產品 <

    反應原理

    在隨機引物標記中，Klenow 酵素在六聚體引物和鹼性 DIG-11-dUTP 的存在下複製 DNA 樣板。平均來說，酵素會在每 20-25 個核苷酸中插入一個 DIG 分子。由此產生的標記產物是均勻標記、靈敏的雜交探針，能夠檢測低至 0.10 - 0.03 pg 的目標 DNA。

    Nick Translation Labeling of dsDNA for In Situ Probes

    缺口轉譯方法是基於 DNase I 在 Mg2+ 的存在下，以低酵素濃度將隨機分佈的缺口導入 DNA 的能力。 大腸桿菌 DNA聚合酶I使用缺口的3´-OH末端作為引物，以5´ - 3´方向合成與完整鏈互補的DNA。DNA 聚合酶 I 的 5´ - 3´ 外核酸分解活性會同時移除合成方向上的核苷酸。聚合酶活性依序將移除的核苷酸置換為同位素標示或合子標示的脫氧核苷酸三磷酸鹽。在低溫 (+15 °C) 下，反應中未標示的 DNA 會被新合成的標示 DNA 取代。對於原位雜交程序，此程序所得到的標記片段長度應約為 200-500 個碱基。

    標籤方法DIG-標籤 試劑其他標籤
    試劑
    Nick Translation

    Nick Translation 套件
    不含酶的標籤混合物
    用於標記的核苷酸  
    酵素

    RNA 探針的轉錄標記

    對於某些應用，DIG 標記的 RNA 是比 DIG 標記的 DNA 更有效的雜交探針。例如，DIG 標記的 RNA 探針可以檢測納克量總 RNA 中的稀有 mRNA。這些標記的 RNA 探針是由 DNA 模板經由 體外 轉錄產生的。在 RNA 轉錄方法中，DNA 被克隆到不同 RNA 聚合酶（如 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶）啟動子之間的轉錄載體的多重克隆位點。然後透過在一個獨特位點（插入物附近）裂解載體，使模板線性化。RNA 聚合酶在核糖核苷酸（包括 DIG-UTP）混合物存在的情況下，將插入的 DNA 轉錄為反義 RNA 副本。在反應過程中，DNA 可以轉錄多次（高達百倍），以產生大量的全長 DIG 標記 RNA 複本（在標準反應中，1 μg DNA 可產生 10-20 μg RNA）。DIG 約每 25-30 個核苷酸納入 RNA 中。

    其他標籤試劑
    體外 轉錄

    DIG Northern Starter Kit
  • DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)
    • <     		<
    不含酵素的標籤混合物
    用於標記的核苷酸
    酶
    其他產品

    反應原理

    將要轉錄的 DNA 範本克隆到適當的轉錄載體的多鏈結位點，該位點包含 SP6 和或 T3 和 T7 RNA 聚合酶的啟動子。在適當的位點線性化之後，在 DIG-11-UTP 的存在下轉錄 RNA。在標準條件下，從 1 μg 模板轉錄出約 10 μg 的全長 DIG 標記 RNA。

    以下提示對於成功的 RNA 探針標記至關重要：

    RNase

    RNase 無處不在，並且不需要任何輔助因數即可進行活動。如果您想成功，請採取一切可能的預防措施來防止 RNase 污染。例如：

    • 建議使用拋棄式塑膠器皿、烤箱烘烤的玻璃器皿，或使用 RNase ZAP 或類似試劑淨化過的塑膠器皿。
    • 用已經用二乙基吡咯碳酸鹽（DEPC）或二甲基二碳酸鹽（DMDC）處理過的水來配製所有溶液，並對溶液進行高壓消毒。模板應高度純化。
    • 最終模板必須線性化、酚/氯仿萃取及乙醇沉澱。

    模板序列

    • DNA模板中的某些引物和/或聚連區域與核糖體28s和18s RNA序列的部分同源。因此，標記探針可能會在含有這些顯著 RNA 的樣本中產生特定但不需要的信號。
    • 如果您使用 PCR 製作 DNA 樣板，Expand High Fidelity 反應的產物會含有一些具有單個 3´ A 懸空的片段。這種懸空可能會在轉錄標記反應中產生包覆產物。

    模板長度

    • 最佳模板長度約為 1 kb
    • 最小長度應至少 200 bp

    探針的儲存

    • 為了長期穩定，RNA 探針應等分並儲存於 -20 °C或 -70 °C
      • 。/li>
    • DIG標記的RNA探針在-20 °C或-70 °C的乙醇中至少可以穩定保存1年

    探針的敏感度

    • 為了快速確定DIG標記的反義RNA探針的靈敏度，請通過體外轉錄製備相應的有義RNA（未標記）。然後使用不同濃度的純化有義轉錄物作為 Northern 印跡的目標。從印跡的結果，您可以很容易地確定標記探針（反義轉錄本）可以檢測到的最低目標（有義轉錄本）量。

    DIG寡核苷酸 5「 末端標記、3」 末端標記和 3' 尾端標記尾部標記

    對於某些應用，例如原位雜交，DIG標記的合成寡核苷酸是最佳的雜交探針。除了原位雜交外，DIG標示的寡核苷酸也可以在許多應用中作為雜交探針，包括點/槽印圖、文庫篩選、在Southern印圖上檢測重覆的基因序列，以及在northern印圖上檢測豐富的mRNA。

    有幾種方法可用於寡核苷酸的 DIG 標記，現概述如下。

    用 DIG-NHS-Ester 進行寡核苷酸 5´ 端標記

    標籤方法DIG-標籤試劑
    5'-End Labeling


    所需的核苷酸：100 nmol

    所需時間和溫度：過夜，+15 至 +25 °C

    • 只需要少量模板
    		其他產品

    用 DIG-ddUTP 進行寡核苷酸 3´ 末端標記

    標籤方法DIG-標籤 試劑其他標籤
    試劑

    3'-End Labeling



    需要的核苷酸：100 pmol
    所需時間和溫度：
    15 分鐘，+37 °C
    可檢測：10 pg DNA

    • 只需要少量的
      樣板
    • 標示探針不需要純化即可使用
    • 如果
      將培養時間增加到 1 小時，反應可以無限擴大
    		標籤的套件

    標籤用核苷酸
    酵素

    加入 DIG-dUTP 和 dATP 的 3´ 尾（約 40 - 50 個殘基）

    加入 DIG-dUTP 和 dATP 的 3´ 尾（約 40 - 50 個殘基

    非放射性寡核苷酸尾隨和檢測

    圖 2.非放射性寡核苷酸尾隨和檢測。

    其他標籤試劑


    所需核苷酸：100 pmol
    所需時間及溫度：
    15 分鐘，+37 °C
    可檢測：1 pg DNA
    •  只需要少量模板
    •  產生比末端標記更靈敏的探針
    •  產生比末端標記更靈敏的探針
    • 標籤探針無需純化即可使用
    • 反應可以無限擴大
    		用於標記的核苷酸
    酵素

    通过直接检测程序估计探针产量

    要在杂交中加入正确量的探针，您必须首先确定标记反应中产生的 DIG 标记探针的量。

    注意：如果您通過 PCR 標記 DNA 探針，您不需要進行直接檢測來評估收率。

    對於 PCR 標記的探針，請使用凝膠電泳評估方法。

    直接检测包括以下步骤：

    • 制备标记探针的系列稀释液并将其点在尼龙膜上（所需时间：15 分钟）
    • 用化学发光检测斑点中的 DIG；所需时间（2-2.5 小時）

    DIG-Related Downloads and Resources

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    僅供生命科學研究使用。不適用於診斷程序。

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