使用密度標記珠進行密度測定
密度標記珠是 Sephadex™ 的染色衍生物。密度標記珠是 Sephadex™ 的染色衍生物,共有十種顏色的標記珠,每種都有特定的密度。它們是專門用於 Percoll 梯度的,不能用於其他培養基。使用密度標示珠作為外部標記,有助於監測梯度的形狀和範圍。細胞或細胞器在梯度中的位置可在使用預製梯度前準確地定位 (73,83)。密度標記珠的密度涵蓋了 Percoll 中絕大多數要分離的細胞和細胞器的浮力密度。除了提供非常快速簡單的密度測量方法之外,使用 Density Marker Beads 還能提供比其他方法更精確的數據,因為完全避免了分析前分餾造成的梯度失真。
Density Marker Beads 對於在進行實際實驗前標準化運行條件也非常有用,使用之前描述的模型實驗可以產生一系列特定轉子和管型的梯度曲線。
密度標記珠 - 特性
每個小瓶中都含有冷凍乾燥的交聯葡聚糖珠,在 Percoll 中具有精確測定的密度。十種珠子類型中的九種可用於含有 0.15 M NaCl 或 0.25 M 蔗糖的 Percoll 梯度。小瓶 5 僅用於含 0.15 M NaCl 的 Percoll,而小瓶 10 所含的珠子僅用於含 0.25 M 蔗糖的 Percoll。
每種珠子的精確密度是針對每個生產批次而特定的,並印在每個盒子的標籤上。
圖 12.如圖 4 所述,密度標記珠在 Percoll 梯度中的分帶(來自 Cytiva,Uppsala,Sweden)。
圖 13.鹽濃度對密度標記珠在 Percoll 梯度中記錄密度的影響。數字代表不同的珠子類型;特定批次的確切密度印在盒子標籤上(Cytiva,Uppsala,Sweden)。
圖 14.蔗糖濃度對密度標記珠在 Percoll 梯度中記錄密度的影響。數字代表不同的珠子類型;特定批次的確切密度印在盒子標籤上(Cytiva,Uppsala,Sweden)。
圖 15.使用密度標記珠和數位密度計(DMA 46,Anton Paar A.G.)對 0.15 M NaCl 中 Percoll 梯度的記錄密度進行相關性分析。馏分大小 2.64 mL,离心机 MSE Superspeed 75,转子 10 × 100 mL,角度 18°,40 000 × g,60 分钟(工作来自 Cytiva,瑞典乌普萨拉)。
密度標記珠的使用
珠子在使用前必須用水膨脹;每小瓶中加入 1.0 mL 無菌水,讓珠子膨脹過夜。如果要將珠子長期儲存在水中,建議加入防腐劑,如 Merthiolate™ (0.01% w/v)。
每次實驗所需的珠子數量取決於離心管的大小,但通常 10 至 15 μL 的懸浮液就足夠 10 mL 的 Percoll。用微量移液管分裝微珠時,最好將一次性塑料吸頭的末端剪掉,以免被微珠堵塞。
密度標記珠的尺寸非常小,可以順利通過管道、監測設備等。密度標記珠已被用於監測分區離心轉子中 Percoll 的梯度。密度標記珠可作為外部標記,置於含有與實驗所用相同梯度材料的離心管中。密度標記珠不應與細胞樣本混合。密度標記珠被添加到對照管中,然後在離心過程中在轉子中用作平衡。
每盒密度標記珠中都包含詳細的使用說明。
注意: 密度標記珠只能用於校正 Percoll 的梯度。
測量密度的其他方法
有幾種技術可用於監測分餾後 Percoll 溶液的密度。秤量空的和裝滿的玻璃微量移液管是精確但繁瑣的方法。也可以在非水有機液製成的預先校正梯度中測量樣品的等容平衡點 (12)。折射率與 Percoll 溶液的密度呈線性關聯,如圖 16所示。使用密度計(例如 DMA 3,Anton Paar A.G.)直接測量是使用密度標記珠(圖 15)的精確替代方法。
圖 16.折射率為 Percoll 漸層密度的函數 (由 Cytiva, Uppsala, Sweden 製作)。
梯度的分餾
離心之後,可以穿刺管子底部,將流出的液體收集成馏分,或利用其他一些技術來分餾梯度(1, 28)。一種簡單方便的方法是利用密度較高的介質,例如未稀釋的 Percoll 或 60% 至 65% 的蔗糖溶液,從管的頂部收集餾分。將這些致密物質抽到管子底部後,就可以從頂部抽出馏分。將密度較高的溶液抽至轉子的遠端,然後從中心收集馏分,即可排空區域轉子。
細胞分選與計數
Percoll 不會干擾螢光活化細胞分選 (FACS) (911, 1042) 或電子計數儀器 (12)。梯度馏分的 DNA 含量也可用作细胞数量的测量 (12)。
蛋白質測定與酵素分析
Percoll會造成Folin-Ciocalteau與Lowry試劑的背景色,所有的測定都應使用Percoll溶液來製備空白。較高的蛋白質濃度可使用生物膽鹼反應 (biuret reaction) 測定 (85)。Terland 等人(89)推薦使用 Coomassie™ Blue 的 Bradford 方法(90),因為 Percoll 不會干擾顯色。Vincent 和 Nadeau (518) 報導了 Bradford 方法的改良,將 Percoll 用 NaOH Triton™ X-100 混合物沉澱。
細胞器通常主要藉由特定酵素的存在來鑑定。許多酵素檢測可以在有 Percoll 的情況下進行而不會受到干擾。Pertoft 和 Laurent (21) 描述了一個實驗,在 Percoll 存在的情況下分析來自大鼠肝臟勻質物質的 5'-nucleotidase (質膜)、葡萄糖-6-磷酸酶 (微粒體)、b-葡萄糖醛酸苷酶 (溶酶體) 和琥珀酸脫氫酶 (線粒體)。在所有情況下,Percoll 與對照組中的活性至少一樣高,顯示測定不受培養基的影響。不穩定的琥珀酸脫氫酶活性被 Percoll 穩定。芳基硫酸酯酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、N-乙酰-a-D-葡萄糖氨糖苷酶和 b-葡萄糖氨糖苷酶也在 Percoll 存在下進行分析,而不會受到培養基的干擾 (21)。由於 Percoll 會造成光散射,因此最好使用利用螢光而非吸光來偵測活性的酵素分析法。有關在 Percoll 中測量酵素的詳細資訊,請參閱參考文獻 13、43、53、54、78 和 89。
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