寡核苷酸標準 6 混合 LC-UV 分析
Jessie Zhixin Miao, Geoffrey Rule, Cory Muraco, Uma Sreenivasan
Merck
寡核苷酸
層析
測量與分析
引言
隨著 COVID-19 的流行，寡核苷酸 (Oligos) 已經證明了其在診斷和治療應用中的重要性。目前，已有 11 種橫跨多種疾病領域的寡核苷酸藥物獲得 FDA 的批准。1、2妨礙寡核苷酸治療藥物快速發展的障礙包括許多臨床試驗中不利於吸收、分佈、代謝、排泄和毒性 (ADMET) 研究的挑戰。2 已經開發了一些策略來應付這些挑戰，例如透過化學改造來改善藥物輸送。
合成寡核苷酸通常是小型、單鏈或雙鏈經改造的核酸。2 目前已有許多成熟的技術可用來分析和表徵寡核苷酸，包括毛細凝膠電泳 (CGE)、離子交換色譜 (IEX) 和離子對反相液相色譜 (IP-RPLC)。一般而言，由於寡核苷酸結構相似、極性極強、存在截短和/或修飾的寡核苷酸、容易自我結合成各種構象，以及與金屬表面的親和性，因此液相色譜法非常具有挑戰性。1,2本應用描述了在 Supelco® 產品組合中的 Chromolith® RP-18e 色譜柱上分離內部生產的寡核苷酸標準 (Oligo Standard 6) 混合物，其中包括六種寡核苷酸。
實驗程序
寡核苷酸標準 6 是用於 HPLC-UV 評估寡核苷酸分離的內部（內部）系統適用性混合物。它包含六種成分，分子量分別為 3588.3 Da (寡核苷酸 1)、4157.93 Da (寡核苷酸 2)、7580.83 Da (寡核苷酸 3)、10014.35 Da (寡核苷酸 4)、6116.97 Da (寡核苷酸 5) 和 4395.8 Da (寡核苷酸 6)，按照它們在這裡測試的 Chromolith® RP-18e 色譜柱上的洗脫順序。
試劑製備
50 mM 醋酸三乙基銨 (TEAA)
製備 1 L 50 mM TEAA 時，將 50 mL TEAA（商業級 1 M 溶液）加入 950 mL HPLC 級水中並充分混勻。
20 mM 的醋酸三乙基銨 (TEAA)
要製備 1 L 的 20 mM TEAA，將 20 mL 的 TEAA（商業 1 M 溶液）加到 980 mL 的 HPLC 級水中並混合攪拌均勻。
5 mM 的醋酸三乙基銨 (TEAA)
要製備 1 L 的 5 mM TEAA，將 5 mL 的 TEAA (商業 1 M 溶液) 加入 995 mL 的 HPLC 級水中並混合攪拌均勻。
樣品製備
5 µM 的寡聚物標準 6 樣品
將 1 mL HPLC 級的水加入含有六種寡聚物成分各 5 nmol 的樣品瓶中，混勻。
HPLC-UV 系統設定與資料分析
以下表 1 列出 HPLC-UV 色譜系統分析 Oligo Standard 6 的基本設定。
結果與討論
由於磷酸基的連結，寡核苷酸容易黏附在不鏽鋼色譜柱硬體和液相層析系統的金屬表面，導致靈敏度降低和定量不準確。3傳統的 HPLC 色譜柱通常包裝在金屬柱中，暴露出帶有正電荷的金屬表面，會吸附酸性分子，例如含有磷酸基團的寡核苷酸。Chromolith® HPLC 色譜柱是由高度多孔的矽石整體棒所組成。這些色譜柱具有創新的雙模孔結構，並採用不含金屬的 PEEK（聚醚醚酮）色譜柱包裝。此特性使其成為寡核苷酸分析的理想選擇。
Chromolith®Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm色譜柱
高流速測試
為了提高分離效率，通常會縮小填料的粒度。目前，傳統的 HPLC 色譜柱包含 5、3、2，甚至 2 微米以下的矽膠顆粒。 然而，較小的顆粒尺寸會造成較高的背壓，影響檢測通量、穩定性和色譜柱壽命。最佳的解決方案是使用既能提供較快的產量，又不會有高背壓風險的色譜柱。由於 Chromolith® 色譜柱並不是由矽膠顆粒包裝而成，而是由高純度的聚合矽膠單棒包裝而成，因此其獨特的結構可在加速的速度下進行高效率的分離，是高通量分析的理想選擇。
圖 1.在 Chromolith®Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6，流速 3 mL/min，梯度 5 % B 至 15 % B，時間 10 分鐘。流動相 A：50 mM TEAA 水；流動相 B：乙腈。進樣量：5 μL (柱上 25 pmol)。
圖1顯示在流速為3 mL/min的Chromolith®RP-18e色譜柱上分離Oligo Standard 6，每種寡核苷酸的柱上注射量僅為25 pmol。50 mM TEAA 用作流動相 A，乙腈用作流動相 B，梯度為 5% B，在 10 分鐘內遞升至 15% B。3 mL/min 時的典型背壓為 50 bar，有利於高通量檢測。
離子配對添加劑濃度測試
在寡核苷酸雜質的定性和定量分析中，離子配對反相液相色譜法一直是主流技術。在流動相中加入的離子配對試劑通常是幾種烷基銨鹽，這些烷基銨鹽吸附在色譜柱吸附劑上，正電荷暴露在外，與帶負電荷的寡核苷酸相互作用。三乙基醋酸銨 (TEAA) 是 LC-UV 分析寡核苷酸常用的離子配對試劑之一。優化離子配對添加劑的濃度，對於達到高效率的分離，同時降低添加劑消耗的成本非常重要。在本工作中，進行了 TEAA 濃度的最佳化。
圖 2A.在 Chromolith® Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6，使用不同濃度的 TEAA，流動相 A: 50 mM TEAA。每兩個相鄰峰之間的解析度計算。
圖 2B.在 Chromolith® Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6，使用不同濃度的 TEAA，流動相 A: 20 mM TEAA。每兩個相鄰峰之間的解析度計算。
圖 2C.在 Chromolith® Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6，在流動相 A: 5 mM TEAA 中使用不同濃度的 TEAA。每兩個相鄰峰之間的解析度計算。
圖 2顯示了以乙腈作為流動相 A，在分離過程中測試不同濃度的 TEAA。在Chromolith® Performance RP-18e, 100 x 4.6 mm色譜柱上注入5微升Oligo Standard 6樣品，流速為1 mL/min，每次測試在10分鐘內以8% B到15% B的梯度進行。在流動相 A 中含有 50 mM TEAA 的情況下，寡核苷酸得到了很好的分離，Oligo 1 至 6 的保留時間分別為 6.051 min、7.232 min、8.476 min、8.647 min、9.058 min 和 10.964 min。當 TEAA 濃度降至 20 mM 時，Oligo 1 至 6 依相同順序洗脫，但在色譜柱上的保留時間較短。除了 Oligos 1 和 2 外，每個峰對之間的解析度也較低。當 TEAA 濃度進一步降低到 5 mM 時，Oligos 4 和 5 並未被分離，這表示離子配對的強度不足以分離這兩個寡核苷酸。比較六個寡核苷酸在三種不同 TEAA 濃度下的峰高，50 mM TEAA 產生的峰高最高，如圖 2中的表格所示。因此，需要根據寡核苷酸的特性優化離子配對添加劑的濃度。
Chromolith® HighResolution RP-18e Column, 2 mm I.
Chromolith® HighResolution（HR）色譜柱擁有 1.15 µm 的大孔，而標準 Chromolith® 色譜柱的大孔只有 2 µm。這種改良使分離效率更高，峰形更好。4
在此，將 3 µL Oligo Standard 6 樣品注入 Chromolith® HighResolution RP-18e, 100 x 2.0 mm色谱柱上，以0.4 mL/min的速度进样，在10分钟内完成从8% B到15% B的梯度进样。以 50 mM TEAA 濃度為流動相 A，乙腈為流動相 B，Oligo 4 與 5 之間的解析度為 4.936。
圖 3.在 Chromolith® HighResolution RP-18e, 100 x 2.0 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6。流動相 A: 50 mM TEAA in water, 流動相 B: 乙腈；梯度：8% B 到 15% B，10 分鐘，流速 0.4 mL/min，柱溫：40 oC，進樣：3μl (15 pmol on column)。
在圖3中使用的相同條件下，以5 µL的進樣量，比較了Chromolith® HighResolution RP-18e, 50 x 2 mm的較短柱。如圖 4所示，在 50 x 2 mm 色譜柱上，所有六種寡核苷酸都在 10 分鐘內洗脫，Oligo 4 和 5 之間的解析度為 3.921。因此，Chromolith® HR RP-18e 色譜柱能夠使用 LC-MS 相容的流速進行寡核苷酸分析。
圖 4.在 Chromolith® High Resolution RP-18e, 50 x 2.0 mm 色譜柱上分離 Oligo Standard 6。流動相 A: 50 mM TEAA in water, 流動相 B: 乙腈；梯度：8% B to 15% B，10 分鐘，流速 0.4 mL/min，柱溫：40 oC，進樣：5 μL (25 pmol on column)。
結論
在本應用筆記中，在標準 Chromolith® 和 Chromolith® High-Resolution RP-18e 色譜柱上展示了內部創建的 HPLC-UV 系統適用性混合物 Oligo Standard 6 的分離效果。在標準 Chromolith® 上評估的流速高達 3 mL/min，六種寡核苷酸的分離效果極佳，顯示它是高通量檢測的理想選擇。討論了離子配對試劑 TEAA 對寡核苷酸標準 6 分離的影響，以提供寡核苷酸分析的最佳化指引。Chromolith® High-Resolution RP-18e 色譜柱經典型 LC-MS 流速評估，證明此色譜柱適用於質譜法的寡核苷酸分析。此外，聚合柱外殼可用作無金屬或生物惰性 HPLC 系統的一部分。
鳴謝
作者感謝 Pierre Potier 提供標準六寡核苷酸混合物和技術支援。
參考資料
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