利用 RP 色譜法進行中間體抗體分析

Benjamin Peters, Gisela Jung

HPLC R&D, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Comparison of Chromolith^® WP 300 RP-18, 2 mm I.D., with Other Columns

引言

分析單株抗體 (mAbs) 是一項困難的分析挑戰，需要多管齊下的方法。除了不同的樣品製備策略外，還需要採用不同的色譜模式來進行完整的表徵。

在反相模式中，通常會進行三層分析：自上而下（完整的）、自下而上（完全消化的縮氨酸片段）和自中而上（較大的蛋白質子單元）。

在自中而上的分析中，會使用消化程序，例如使用二硫蘇糖醇 (DTT) 或 IdeS（一種蛋白酶），將蛋白質分解成較大的片段。DTT 可將 mAb 分解成輕鏈 (LC) 片段和重鏈 (HC) 片段；IdeS 可將 mAb 分解成可結晶 (Fc) 片段和抗原結合片段 (Fab)。

本應用的目的是將 SigmaMAb 抗體參考標準和 NISTmAb 參考標準進行 DTT 和 IdeS 消解，然後用 RPC 分析每個產生的消解物。此外，還將採用一系列色譜柱進行分析，並檢查選擇性、效率和峰形的差異。

圖 1. 經過 a) DTT 和 b) IdeS 處理後的 IgG 抗體消化產物

實驗競賽

表 1.實驗條件

欄位：	如指示；10 cm x 2.1 mm I.D、2.0 µm (SPP)、1.7 µm (FPP)、10 cm x 2 mm 內徑。D (Chromolith®)
检测：	UV @ 220 nm (analytical flow cell; 10 µL)
移動相：	[A]水 (0.1% TFA v/v); [B]乙腈 (0.08% TFA v/v)
梯度：	時間 (min) 0 min 1 min 10 min	%B 20 20 45
樣本：	消化的mAb，不同濃度，水（0.1% TFA v/v)
样品准备（DTT 法）：	將 60 µL 40 mM DTT 溶液加入 40 µL mAb 中，置於小瓶中於 37 °C 孵育 30 分鐘。
Sample Prep (IdeS Method)：	將 4 µL IdeS 和 56 µL 水與 40 µLL mAb，並在 37 °C 下孵育 30 分鐘
注射量：	1。0 µL
流速：	0.38 mL/min
溫度：	色譜柱：80 °C 自動取樣器: 10 °C
壓降：	如指示

結果

圖 2. Chromolith^® WP 300、SPP 和 FPP 填料柱在分析 DTT 還原 SigmaMAb 時的分離性能比較。Chromolith^® 與這些 UHPLC 色譜柱的性能相當，但背壓較低。

圖 3. 比較 Chromolith^®、SPP 和 FPP 填料柱在分析 DTT 還原 NISTmAb 時的分離性能。Chromolith^® 與 UHPLC 色譜柱的性能相當，但背壓明顯較低。

圖 4. 比較 Chromolith^®、SPP 和 FPP 填料柱在分析 IdeS 還原 SigmaMAb 時的分離性能。Chromolith^® 能以高解析度分離 Fab 和 Fc 物種，而不會因為較高的壓力而產生假象，如 FPP 和 SPP 中分別有額外的峰和峰擴闊所示。

圖 5. 比較 Chromolith^®、SPP 和 FPP 填料柱在分析 IdeS 消化 NISTmAb 時的分離性能。Chromolith^® 色譜柱的表現與 UHPLC 色譜柱一樣好。

結論

本研究的目的是比較一系列色譜柱在消化後用 RPC 分離中等大小抗體片段的性能。本研究使用了兩種不同的消解方案：DTT 和 IdeS。所有這三種色譜柱都在兩個蛋白質亞單位之間達到了極佳的解析度。對於 DTT 消解，Chromolith^® WP 300、2 mm 內徑色譜柱的超高效液相色譜性能與兩種專用超高效液相色譜柱相當，顯示其具有同等的分離性能。

在 IdeS 消化中，Chromolith^® WP 300, 2 mm I.D. 色谱柱比 SPP 色谱柱具有更好的分离性能，SigmaMAb 和 NISTmAb 中 Fab 峰周围变体的分辨率提高就说明了这一点。在 FPP 上 SigmaMAb 的 Fab 峰上出現的看似峰分裂的現象，實際上是在 FPP 上看到的高背壓所產生的新變異。在 Chromolith^® WP 300, 2 mm I.D. 色譜柱上，這種假象得到了緩解，而不會影響效率。進一步的研究將探討此變體的組成。

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