Prestige 抗體^®在免疫螢光中的應用

亞細胞定位研究的必要性

研究特定蛋白質的亞細胞位置的一個主要理由是，位置通常與功能緊密相關。例如，定位在細胞核的蛋白質經常與基因調控有關，線粒體中的蛋白質與能量產生有關，而與 Golgi- 相關的蛋白質則經常與蛋白質的修飾和分類有關。除了闡明蛋白的功能特性外，亞細胞位置資訊也有助於蛋白互作研究。兩個蛋白互作的先決條件是它們必須定位在相同的定義位點。

人類蛋白質圖集計畫

人類蛋白質圖集 (HPA) 計畫 (proteinatlas.org）成立於 2003 年，目的是利用以抗體為基礎的蛋白質組學¹，對人類蛋白質體進行有系統的基因組探索。這是透過結合高通量的 Prestige 抗體^® 生成與多種人體組織和細胞中的蛋白質分析來實現的。由於使用免疫組織化學很難獲取細微亞細胞層次的空間資訊，表達分析已擴展到使用螢光標記抗體的共焦顯微鏡分析^2,3。每年約有 2,500 種新蛋白質的蛋白表達和定位資料加入入口網站。

人類蛋白質圖集中的免疫螢光 (IF) 分析

為了達到亞細胞蛋白質圖集的目標，共聚焦顯微鏡被選作成像系統，以合理的通量達到最高的空間分辨率。此方法選擇了三種人類細胞株：U-251 MG (膠質瘤)、U-2 OS (骨肉瘤) 和 A-431 (上皮細胞癌)，以及三種參考標記：染色核的 DAPI 和染色微管 (anti-tubulin) 及內質網 (antialreticulin) 的抗體。這些標記可作為樣品固定、滲透和免疫染色的對照4，也可作為影像註釋的指引，以指定亞細胞位置。自 2012 年起，細胞系面板已擴大至包括另外八種不同的細胞系。根據 RNA 序列資料，現在每個抗體都會從細胞系面板中選擇兩個合適的細胞系進行免疫螢光分析。

抗體稀釋和免疫染色程序是自動化的，共聚焦顯微鏡影像是手動取得和註釋，並與文獻比較。有 16 個不同的亞細胞位置被註釋 (圖 1)，染色會進一步分析，以四個等級的強度來評分，並指定染色特徵。

圖 1. 人類蛋白質圖集門戶上的蛋白質目標被分配到 16 個不同亞細胞區間中的一個或幾個；核（HPA002844），核膜（HPA003436）、細胞質（HPA006035）、病灶黏附位點（HPA001672）、細胞結（HPA002290）、中心體（HPA003906）。HPA 產品編號是指圖片中使用的 Prestige Antibody^®。Prestige Antibody^® 染色以綠色顯示，核染色以藍色顯示，微管染色以紅色顯示。

圖 2 說明了核染色模式的差異。八種不同的蛋白定位于核仁、核小葉或核膜，並顯示出不同的染色特徵，如平滑、粒狀、斑點和斑簇。

圖 2. 八種不同抗體在細胞株 U2-OS 或 A-431 中所顯示的核染色模式的多樣性。A) 抗MECP2 (HPA006628 的無核小球核染色) , C) 用抗 ZSCAN1 (HPA005895 進行核小葉內的簇染色) , E) 核膜染色(抗-UNC84B(HPA006669)G) 抗 RBM25（HPA005516）核體（SMN）染色。

在人類蛋白質圖集門戶上，每種 Prestige Antibody^®  和細胞系都會顯示兩張圖片，每張圖片包含 6-12 個細胞。可點選圖像以獲得更高解析度。此外，可點選三種不同的通道，以藍色、紅色和黃色顯示三種標記。抗體染色以綠色顯示（圖 3）。

圖 3. Anti-ZYX (HPA004835)顯示 A-431 細胞中局灶黏連的染色。通過點擊不同通道，可將圖像與一個或多個參考標記進行可視化。A) 以綠色顯示抗體染色，B) 以藍色加入 DAPI 核參考，C) 以紅色加入微管參考，D) 以黃色加入內質網 (ER) 參考。

根據與UniProtKB/Swiss-Prot資料庫中可用的實驗基因/蛋白質特性資料的一致性，為每個細胞系分配觀察到的染色的驗證分數，並分為支持、不確定或不支持。約有 30% 的抗體被評為支持（Supportive），即與可用的亞細胞定位資訊一致。對於60%有指定亞細胞位置的基因，缺乏足夠的文獻作為參考，因此抗體結果被評為Uncertain.

HPA IF Protocol

主要抗體：Atlas 抗體，工作濃度為 1-4 µg/mL.雞抗Calreticulin多克隆抗體，稀釋1000倍。小鼠抗 alpha Tubulin 單克隆抗體，稀釋 1000 倍。

二抗：Alexa^® Fluor 555 羊抗鼠 IgG 稀釋 800倍。Alexa^® Fluor 647 山羊抗雞 IgG 稀釋 800 倍。Alexa^® Fluor 488 羊抗兔 IgG 稀釋 800 倍。Alexa^® Fluor 是 Invitrogen 的註冊商標。

1. 所有清洗均在室溫 (RT) 下進行。
2. 在多孔玻璃底板上塗上纖維連接素（濃度 12.5 µg/mL），在 RT 下放置 1 小時。
3. 接種細胞（每孔 10.000-15.000 cells per well) and incubated at 37 °C in humified air with 5.2% CO₂ for at least 4 h.
4. 去除生长培养基，用PBS（8.1 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl，pH 7.2）。
5. 將細胞固定於冰冷的 4% 多聚甲醛 pH 7.2-7.3 中 15 分鐘，並以補充 10% 胎牛血清 (FBS) 的生長培養基固定。
6. 在 PBS 中用 0.1% Triton X-100 滲透細胞 3x5 分鐘。
7. 用 PBS 洗細胞，然後在添加了 4% FBS 的 PBS 中用一抗在 4 °C 孵育過夜。
8. 翌日，用 PBS 洗細胞 4x10 分鐘，然後用加入 4% FBS 的 PBS 中的二抗在 RT 中孵育 1.5 小時。
   
   注意：二抗是螢光標記的，因此對光敏感。
   
   
9. 在 PBS 中用 0.6 µM 的核染色 DAPI 反染細胞 4 分鐘。
10. 以 PBS 洗細胞 4x10 分鐘，並以甘油 + 10% 10xPBS 裝片。

摘要

• 細胞下定位研究是闡明蛋白功能和互作的關鍵步驟。
• 在人類蛋白質圖集計畫中，目標蛋白的細胞下定位資訊是透過三種不同的人類細胞系的共焦顯微鏡分析獲得的。
• 人類蛋白質圖集門戶上顯示的所有 IF 圖像都是可視化的，不同的細胞器探針在多色圖像中顯示為不同的可點選通道。

參考資料

1. Uhlen M, Oksvold P, Fagerberg L, Lundberg E, Jonasson K, Forsberg M, Zwahlen M, Kampf C, Wester K, Hober S, et al. 2010. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nat Biotechnol. 28(12):1248-1250. https://doi.org/10.1038/nbt1210-1248

2. Lundberg E, Uhlén M. 2010. Creation of an antibody-based subcellular protein atlas. Proteomics. 10(22):3984-3996. https://doi.org/10.1002/pmic.201000125

3. Barbe L, Lundberg E, Oksvold P, Stenius A, Lewin E, Björling E, Asplund A, Pontén F, Brismar H, Uhlén M, et al. 2008. Toward a Confocal Subcellular Atlas of the Human Proteome. Mol Cell Proteomics. 7(3):499-508. https://doi.org/10.1074/mcp.m700325-mcp200

4. Stadler C, Skogs M, Brismar H, Uhlén M, Lundberg E. 2010. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73(6):1067-1078. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2009.10.012