Histopaque^® 密度梯度介質疑難排解指南

Mark Frei

以下關於在細胞分離技術中使用 Histopaque 和 ACCUSPIN™ 的故障排除建議是由我們的技術支援科學家根據觀察和解決客戶問題的經驗編寫而成。本指南針對使用 Histopaque 時最常見的錯誤來源進行說明，但並非一份全面的清單。

血液或細胞樣品疑難排解技巧
Materials

使用 Histopaque/ACCUSPIN 時觀察到的典型問題

• 從人血中分離單核或多形核細胞困難
• Low recovery
• Red blood cell, platelet, or neutrophil contamination in separated cells

血液或細胞樣本故障排除提示
解決方案
使用分離前 2-6 小時抽取的血液。	使用分離前 2-6 小時抽取的血液，24 小時內抽取的血液較難分離，且回收率和存活率較低。
建議使用預先量測抗凝劑的真空管。
確保抽血後已充分混合含有抗凝劑的真空管。
下列抗凝劑適用於 Histopaque：        - 每毫升全血含15-30單位肝素       - 每毫升全血含1.25-1.75 mg EDTA 每 mL 全血 ACA-A (Acid Citrate Dextrose formula A) 可用作抗凝劑。分離後，產生的單核細胞帶會比其他抗凝劑更寬。
紅血球污染可能是血液未達室溫所致。 抽血後，應讓血液在室溫下冷卻至少 30-45 分鐘。如果抽血後立即使用，收集到的單核細胞數量會很低。當血液和 Histopaque 都在 18-20 °C 時，分離程序最為理想，可接受的溫度範圍為 18-26°C。
歷史上使用 Histopaque 的細胞分離技術包括使用 PBS (1:1) 稀釋血液。 含有 150 mM 磷酸盐缓冲液和 150 mM 氯化钠的溶液是盐浓度过高的 PBS 溶液，不适合与 Histopaque 一起使用。PBS 摩爾數接近 10 mM 磷酸鹽更適合與 Histopaque 搭配使用。如果以適合的細胞培養基取代高鹽分濃度的 PBS，細胞存活率仍會較高。
高血脂、類風濕因子、貧血及藥物治療都可能是造成特定捐獻者血液分離不良的原因。 如果血漿不清，這表示脂質含量高。
從非針頭出血處取得的血液，例如、	從非針頭出血（例如：從尾部取樣）中取得的血液通常無法使用，因為在收集的血液中會有毛髮和其他體液。 建議犧牲動物，經由主動脈或腔靜脈或其他大血管取得血液。 建議犧牲動物，經由主動脈、腔靜脈或其他大血管取得血液，或使用小兒真空管抽血。
當紅細胞與聚蔗糖接觸時可能會形成聚集體，導致白細胞閉塞。 對於常規血液樣本，未稀釋血液的回收率通常較高。然而，骨髓、臍帶血和白細胞數異常高的捐贈者樣本應該稀釋，以減少紅細胞聚集的大小，提高白細胞的回收率。
當血液稀釋後再載入Histopaque®時，有可能緩衝液或培養基配方與Histopaque®不相容，或是PBS或細胞培養基受到污染。 如果血液已被稀釋且產量不佳，請在未稀釋樣品的情況下重複實驗。
稀釋樣本與 Histopaque 一起使用時，可用不含 FBS 的細胞培養基代替 PBS。如果用含有 FBS 的細胞培養基稀釋血液，回收的細胞數就會較少。 在細胞分離後，可將 FBS 加入培養基中進行後續洗滌或儲存，並至少洗滌一次以去除 Histopaque。在第一次水洗後，在水洗培養基中加入蛋白質（如 FBS）可進一步保護細胞免受損傷。
紅血球是在適當的抗凝劑中收集血液並離心製備的。紅細胞會凝集到管子底部。紅細胞層的正上方會有一層灰色層。此灰色層為水包衣，代表血液中的所有白血球。 由新鮮血液製備的水銅衣適合使用 Histopaque 進行分離。如果細胞是幾天前的，例如、 Buffy coats必須稀釋至少1:2或1:4，才能載入Histopaque梯度。
水包衣製劑不能用於 ACCUSPIN 管。ACCUSPIN 管需要一定數量的紅細胞才能正常工作，而水凝膠缺乏足夠的紅細胞，無法用於 ACCUSPIN 管。

Histopaque/ACCUSPIN 疑難排解提示
Histopaque 為無菌溶液。
Histopaque以無菌溶液製造。不含防腐劑，可降低污染機會。
如果Histopaque或填充ACCUSPIN的試管在低溫使用，產量通常很低，而且可能觀察到細胞結塊。紅血球污染也可能是因為 Histopaque 未達室溫所致。一瓶 100 mL 或 500 mL 的 Histopaque 儲存於 2-8 °C，可能需要數小時才能達到 18-20 °C。當計劃使用 Histopaque 時，我們建議在前一天將 Histopaque 從冰箱中取出，讓瓶子在工作台上放置一夜。 另一個選擇是將適量的Histopaque轉移到每個離心管或ACCUSPIN管中，並讓較小的容量適應室溫。 收集細胞帶並進行第一次洗滌後，在 4 °C 下進行其餘的洗滌步驟是可以接受的。

技術疑難排解技巧
解決方案
將血液分層至單核細胞梯度時，不需要精確分層。 一旦血液分層後，必須立即將離心管放入離心機。如果時間過長，整層 Histopaque 將被紅細胞染紅。根據 「液滴形成 」的數量，這可能會降低單核細胞的回收率。一次處理的試管數量應加以限制，以減少這種細胞分散的情況。
分離中性粒細胞時，Histopaque® 1077 和 Histopaque 1119 的正確分層	同時使用Histopaque 1077和Histopaque 1119分離中性粒細胞時，必須使用謹慎的技術以防止溶液界面混合。 使用 Schlieren 光學檢查介面的完整性。當將試管對著光線時，層間介面上的任何漩渦或混合應是明顯的。 如果界面準備妥當，則應該有一條明確的分界線。 如果沒有明確的分界線，或者界面上有漩渦，則丟棄試管，重新開始。1077 和 1119 之間沒有化學差異；兩種溶液具有相同的成分，並會隨著時間開始一起擴散。
不应该使用粉末手套。手套粉末會導致細胞聚集。只能使用不含粉末的手套。
應檢查離心機，以確保校正正確。過大的離心力（更高的離心速度）會降低產量。
組織蛋白不能通過高壓滅菌；高壓滅菌會使溶液中的多聚蔗糖焦糖化，變成棕色。使用 0.22 微米的濾網將 Histopaque 無菌過濾是可以接受的。
血小板污染或中性粒細胞污染通常是在收集細胞帶時收集了太多的血漿或Histopaque 1077或1083所致。
清洗细胞团时通常会去除血小板。If a large amount of wash solution is left over the cell pellet, this results in more platelets in the cell suspension. Remove as much wash media as possible without disturbing the cell pellet.血小板通常在離心力1000 × g 10分鐘以下不會凝集。在洗滌步驟建議的較低離心速度下，血小板應保持懸浮在洗滌培養基或上清液中。
重新懸浮細胞顆粒時，只需使用少量的洗滌液。我們建議在 15 mL 或 50 mL 離心管中進行此程序時，清洗液不超過 0.5 mL。這種洗滌培養基被輕輕地沖洗在沉澱物上。 可能需要將細胞懸浮液吸到移液管中並分注幾次。
偶尔细胞会粘附在离心管壁上。 改用其他批次的聚苯乙烯離心管，或改用聚乙烯等其他類型的塑料。聚苯乙烯管最常被觀察到導致此問題，但其他類型的塑膠也有細胞黏附的報告。

材料

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