原代人肝 Kupffer 細胞培養規程

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• 什麼是肝 Kupffer 細胞？ 

  肝 Kupffer 細胞又稱為 Browicz-Kupffer 細胞和星狀巨噬細胞，是肝內專門的巨噬細胞，排列在肝竇的壁上。

  肝臟 Kupffer 細胞密切參與肝臟對感染、毒素、缺血、切除和其他壓力的反應。激活後，Kupffer 細胞會釋放出各種產品，包括細胞因子、前列腺素、一氧化氮和活性氧。這些釋放的分子會調節其他 Kupffer 細胞和鄰近細胞，例如肝細胞、星狀細胞、內皮細胞和其他在肝臟內穿梭的免疫細胞。在體外，這些細胞不會增殖，也無法傳代。

  我們冷凍保存的肝臟 Kupffer 細胞來自人類肝臟，每位捐贈者都有文件證明同意研究使用不可移植的器官或組織。經過原代培養後，這些細胞會被冷凍保存。每個批次的細胞都經過特定細胞標記、LPS 刺激後的細胞因製造活化折疊測試，並保證解凍後細胞存活率≥70%。在本方案中，我們將示範如何解凍、平板培養原代人肝 Kupffer 細胞。

  肝 Kupffer 細胞培養材料

  • 正常人肝 Kupffer 細胞
    注意：收到後，立即將冷藏瓶儲存於氣相液氮中。
  • Collagen Type I, Rat Tail
  • 組織培養處理多孔板
  • Kupffer維護培養基²：

Components	Final Dilution	Final Conc.	Williams' Medium E	W1878-500ML			1x	470
FBS	ES-009-M			5%	25
Insulin	I9278-5ML	10mg/mL（1.7mM)	1700x	1µM	0.29
Pen/Strep	P7539	100x	100x	1x	5
				500

HEPATIC KUPFFER CELL CULTURE METHODS

除非另有直接說明，否則這些方案均使用 II 級層流生物箱進行。所使用的培養箱經過加濕，溫度設定為 37°C、5% CO₂。研究人員應該穿戴個人防護裝備，包括安全眼鏡、手套和白大褂。

 製備膠原塗層培養板

1. 在無菌 70% 乙醇中製作最終濃度為 56µg/mL 的膠原溶液。
2. 用膠原蛋白/乙醇溶液完全覆蓋培養孔或培養瓶底部。
3. 輕輕攪拌細胞培養板，使膠原蛋白/乙醇溶液均勻覆蓋培養孔或培養瓶底部。
4. 將培養板或燒瓶置於層流罩中晾乾，蓋上蓋子或蓋子蓋上以防止冷凝水凝結，放置一夜。

解凍和培養 Kupffer 細胞

開始前，請準備膠原蛋白 I 塗層的培養器（見上述方案）。不要預熱培養基解凍細胞。Kupffer 細胞在 37°C 時很容易附著在錐形管的管壁上。

1. 將 Kupffer 細胞瓶放入 37°C 水浴中，輕輕轉動小瓶，直到細胞完全解凍。立即從水浴中取出小瓶，擦乾並用 70% 乙醇沖洗，然後移到無菌區。
2. 將解凍的細胞轉移到盛有 9 mL COLD (4°C) Kupffer Cell Medium 的 15 mL 錐形管中，並將管子放在冰上。離心後，吸出培養基，將細胞顆粒重悬於 1mL COLD Kupffer Cell Medium 中。

注意：細胞顆粒會非常小。使用P1000微量移液器重悬，因为使用血清移液器重悬可能导致细胞结块。

1. 使用胰蓝排除法计数细胞。
2. 將細胞稀釋在 WARM Kupffer Cell Medium 中至 400,000 cells/mL。
3. 將 100,000 cells/cm² on cultivating ware coated with collagen type I (Refer to the table below)

1. 使用胰盤藍排除法點算細胞數目。

Format	Cells per cm2	0.056	100,000	5,600	2.15 x 106
0.32	100,000	32,000	3.07 x 106
1.02	100,000	102,000	4.89 x 106
1.94	100,000	194,000	4.66 x 106
3.87	100,000	387,000	4.64 x 106
9.62	100,000	962,000	5.77 x 106
56	100,000	N/A	5.60 x 106
60mm Dish	21	100,000	N/A	2.10 x 106
35mm Dish	8	100,000	N/A	800,000
T-25 Flask	25	100,000	N/A	2.50 x 106
T-75 Flask	75	100,000	N/A	7.5 x 106

7. 將細胞置於37°C/5% CO₂的加濕恆溫箱中，讓細胞附著4-6小時至過夜。

注意：人 Kupffer 細胞可以使用真空抽吸法輕鬆取出。使用時請小心。

8. 附著後，換上新鮮的 WARM Kupffer Cell Medium。
9. 24 小時後，換上加熱的 Kupffer Cell Medium 並繼續您的實驗。 

注意：這些細胞不能增殖，也不能傳代。

圖一 a.) 6 小時、b.) 24 小時及 c.) 48 小時後 Kupffer 細胞培養的顯微鏡影像範例。

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參考資料

1. Seki S, Ikarashi M, Nakashima M, Nakashima H. 2014. New Findings about Liver Kupffer Cells/Macrophages, B Cells and their Functions. J Hepat Res. . 1(1):1003. https://austinpublishinggroup.com/hepatitis/fulltext/hepatitis-v1-id1003.php

2. Su GL, Goyert SM, Fan M, Aminlari A, Gong KQ, Klein RD, Myc A, Alarcon WH, Steinstraesser L, Remick DG, et al. 2002. Activation of human and mouse Kupffer cells by lipopolysaccharide is mediated by CD14. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 283(3):G640-G645. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00253.2001