“Pull-down” de proteínas
O ensaio de pull-down é projetado para determinar a interação entre duas ou mais proteínas. Com os ensaios de afinidade por pull-down, uma proteína "isca" é marcada e capturada em um ligante imobilizado (microesferas de suporte) por ligação covalente ou através de uma cauda de afinidade, como cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). As caudas de fusão de proteínas-“isca” comuns incluem glutationa S-transferase (GST) e proteínas com cauda de histidina. A proteína “isca” forma um complexo que é, em seguida, incubado com uma fonte de proteína, como um lisado de células ou tecido. As proteínas de interesse são eluidas das microesferas de suporte através de uma série de lavagens, e são coletadas por centrifugação. O método de afinidade por pull-down de purificação e detecção é diferente dos ensaios de imunoprecipitação (IP) e Co-IP, pois não se baseia em uma interação de anticorpo com antígeno. Com todos os ensaios de pull-down, a amostra purificada é frequentemente analisada por SDS-PAGE, análise espectral em massa e detecção por western blot para outras análises a jusante.
Artigos técnicos relacionados
- Differential centrifugation and density gradient centrifugation are two types of centrifugal techniques for separating particles.CsCl gradient centrifugation, or Caesium chloride centrifugation is used to make solutions for the separation of RNA from DNA by density gradient centrifugation.
- Centrifugation enables the separation of particles by sedimentation. Learn how to separate particles using a centrifuge and how to use Stokes' law to calculate the velocity of sedimentation.
- Sera-Mag and Sera-Mag SpeedBeads provide cost effective magnetic bead separation technology for molecular biology applications, nucleic acid isolation, and research immunoassays.
- Agarose beads Vs. Magnetic beads in Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- This page describes immunoprecipitation (immunoaffinity or pull-down techniques).
- Ver todos (10)
Protocolos relacionados
- To determine the molecular weights of protein antigens, to study protein/protein interactions, to determine specific enzymatic activity, to monitor protein post-translational modifications and to determine the presence and quantity of proteins.
- Immunoprecipitation Kit (Protein G) Protocol & Troubleshooting
- Immunoprecipitation Kit (Protein A) Protocol & Troubleshooting
- Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetic Particles provide a fast and convenient method for both manual and automated magnetic isolation of proteins using affinity binding. The particles can be used for isolating antibodies from serum, cell culture supernatant or ascites, and for immunoprecipitation and co-immunoprecipitation of antigens from cell or tissue extracts.
- The following material related to Nanodisc Technology is adapted from on-line content of the research group of Professor Stephen Sligar of the University of Illinois at Urbana-Champaign, with the kind permission of Professor Sligar.
- Ver todos (13)
Encontre mais artigos e protocolos
Aplicações de afinidade por pull-down com GST
A glutationa S-transferase (GST) é uma proteína de 211 aminoácidos que é encontrada na maioria dos organismos. A GST é frequentemente integrada nos vetores de expressão para produzir a cauda de fusão dentro dos sistemas de expressão de proteínas de E. coli. A cauda de GST é uma cauda proteica grande de aproximadamente 26 kDa, e pode ser expressa em células de bactérias, leveduras, mamíferos e insetos. A cauda de GST é vantajosa quando é necessário proteger a proteína recombinante da clivagem da protease intracelular, e quando há a necessidade de aumentar a solubilidade da proteína marcada. Além disso, a proteína GST fornece uma cauda de alta afinidade para fácil purificação e para experimentos de pull-down utilizando resinas de afinidade baratas que são realizadas em condições brandas de diluição.
Coimunoprecipitação
O ensaio de pull-down é ideal para verificar os resultados da coimunoprecipitação e um excelente método de identificação de interações proteicas desconhecidas, bem como do status de ativação de proteínas específicas. Diferentemente dos métodos de afinidade por pull-down, a IP utiliza anticorpos para se ligar e isolar antígenos de amostras biológicas complexas.
A Co-IP refere-se ao uso de um anticorpo para ligar um antígeno dentro de um complexo multiproteico. O complexo é, em seguida, capturado com a adição de meio de proteína A ou proteína G. A alta afinidade das proteínas A/G com a região Fc de anticorpos do tipo IgG policlonais e monoclonais faz delas um componente crítico na purificação da proteína ou do complexo proteico de interesse. O uso de métodos de pull-down de proteínas é uma ferramenta essencial para investigar as redes de interações proteicas; no entanto, a escolha do método específico será determinada pela necessidade específica da aplicação do pesquisador.
Para continuar lendo, faça login ou crie uma conta.
Ainda não tem uma conta?