Western blot
O western blot é uma técnica analítica bem estabelecida para detectar, analisar e quantificar proteínas. Este método é amplamente utilizado para detectar moléculas de proteínas específicas em amostras complexas, como em homogenados de tecidos e lisados celulares. O western blot normalmente envolve a separação de proteínas por eletroforese em gel, seguida por transferência para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose. Após a transferência das proteínas, elas podem ser coradas para serem visualizadas e identificadas diretamente por sequenciamento N-terminal, espectrometria de massa ou imunodetecção.
Na imunodetecção por western blot, as proteínas são identificadas por meio de sua ligação a anticorpos específicos. Tipicamente, um anticorpo primário é usado em combinação com um anticorpo secundário conjugado a HRP ou AP para detecção por quimiluminescência ou colorimetria usando um substrato apropriado. Alternativamente, um anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente pode ser usado para visualização direta.
Artigos técnicos relacionados
- Explore the basics of working with antibodies including technical information on structure, classes, and normal immunoglobulin ranges.
- We offer a broad range of alkaline phosphatase enzymes and substrates that are optimized for conjugation to antibodies and other proteins for your specific application needs.
- Loading controls in western blotting application.
- Gelatin is a heterogeneous mixture of water-soluble proteins extracted by boiling skin, tendons, ligaments, bones, etc. in the water.
- Troubleshoot protein transfer issues in Western blotting by understanding causes and optimizing transfer conditions.
- Ver todos (34)
Protocolos relacionados
- Protocolo para preparação de amostras para lise celular e extração eficiente de proteínas de tecidos e células cultivadas para posterior Western blot.
- Protocolo de Western blot com etapas de fluxo de trabalho para diferentes procedimentos de blotting, descrevendo a transferência eletroforética de proteínas de géis de poliacrilamida SDS para folhas de nitrocelulose. Também conhecido como protocolo Immunoblotting.
- BCIP/NBT substrate produces stable, intense color for alkaline phosphatase assays, ideal for visual observation.
- This page describes chemiluminescence detection of GST-tagged proteins with Amersham ECL, Amersham ECL Prime, and Amersham ECL Select from Cytiva.
- The SNAP i.d. 2.0 Protein Detection System is the second generation of the SNAP i.d. method for detecting immunoreactive proteins on Western blots.
- Ver todos (18)
Encontre mais artigos e protocolos
A técnica de western blot é amplamente utilizada em bioquímica para detectar a presença de proteínas específicas, determinar a extensão das modificações pós-tradução, verificar a expressão proteica em aplicações de clonagem, analisar os níveis de expressão de proteínas e biomarcadores, no mapeamento de epítopos de anticorpos e para testar quanto à presença de marcadores de doenças em contextos clínicos.
A necessidade de analisar simultaneamente mais proteínas em amostras limitadas impulsionou pesquisas contínuas para melhorar a sensibilidade e a velocidade das técnicas de blot. A realização de blot duplo elimina os falsos positivos causados por interações inespecíficas. A técnica de far-western blot possibilita a detecção de interações proteicas específicas. A técnica de southwestern blot é usada para identificar proteínas que interagem com sequências específicas de DNA. A técnica de blot com várias tiras (multistrip) aumenta o rendimento ao mesmo tempo em que minimiza a variabilidade entre blots. Novas tecnologias estão sendo desenvolvidas para reduzir as quantidades de proteína necessárias para produzir um sinal e melhorar a capacidade quantitativa do western blot.
Fluxo de trabalho
Eletroforese em gel
A eletroforese de proteínas em gel é usada para separar e resolver proteínas antes da análise por técnicas de blot. A mistura de proteínas preparada é analisada em um gel de poliacrilamida para separar as proteínas de acordo com o seu peso molecular e carga.
Transferência para uma membrana
As proteínas separadas no gel por eletroforese são imobilizadas por transferência para uma membrana de PVDF ou nitrocelulose. A transferência usa corrente elétrica para “puxar” as proteínas do gel para a membrana (eletroblot).
Detecção
A proteína-alvo é detectada usando um anticorpo primário em combinação com um anticorpo secundário, conjugado a HRP ou AP, e um substrato quimiluminescente ou colorimétrico apropriado, ou usando anticorpo primário ou secundário com marcação fluorescente.
Destaques
Download do eBook: Manual de técnicas de blot de proteínas (Protein Blotting Handbook) – Descubra dicas e truques para revelar dados publicáveis de western blot.
Para continuar lendo, faça login ou crie uma conta.
Ainda não tem uma conta?