实验设计与分析——实验设计常见问题

您推荐哪些对照品？

当使用MISSION® TRC shRNA构建体进行实验时，选择适当对照品是您的实验设计的关键要素，以便准确解释敲低结果。所有对照品均以纯化质粒DNA和慢病毒颗粒形式提供。

此外，MISSION® TurboGFP对照转导颗粒（货号SHC003V）可在首次使用细胞系时优化转导效率。

我们推荐的shRNA实验对照品可参见对照品选择表。

最佳阴性对照品是 MISSION®非靶向shRNA或空载体对照品（货号分别为SHC002/SHC002V 或 SHC001/SHC001V）。

为什么非靶标对照载体不影响基因表达？

非靶标对照载体（产品编号SHC002，SHC002V）在shRNA中与任何已知的人类或小鼠基因至少有5 bp错配，从而限制了其靶向任何人类或小鼠基因的能力。有关发卡序列和载体图谱，请查看产品列表。

提供的慢病毒量能感染多少细胞？

可被感染的细胞数量取决于所使用的细胞系。对于HeLa、A549和HEK293T细胞，我们在96孔板中含有约16,000个细胞的每孔使用4μl（1 x 10⁶TU / ml，p24测定法）。原代或其他困难细胞可能需要更多的慢病毒上清液，但即使达到10μl水平，它也会给你足够的量进行20x96孔反应。如有必要，我们建议减少接种细胞的数量以增加感染复数（MOI）。而且，在您的细胞系上限定稀释滴度将为您提供每次检测所需的最佳病毒颗粒量。

您推荐的筛选稳定克隆的方法是什么，有没有一对引物可通过PCR筛选？

最好的方法是通过使用针对目的基因设计的引物来筛选敲低。可以使用针对PAC或目的靶基因设计的引物，通过qRT-PCR筛选耐嘌呤霉素的克隆。

用嘌呤霉素筛选，为什么没有存活的细胞？

您正在使用的细胞可能对嘌呤霉素敏感。加入到细胞中的嘌呤霉素浓度可能太高。对于使用的每种新细胞类型，建议进行嘌呤霉素滴定以确定有效选择转染或转导细胞所需的嘌呤霉素最低浓度。另外，一定要等转导后48小时再对细胞使用抗生素。或者，有效的转导可能需要更高MOI或转导增强方法，如ExpressMag®。

嘌呤霉素滴定（杀伤曲线）应如何设置？

1. 将1.6 x 10⁴个细胞加入装有120 ml新鲜培养基的96孔板的孔中。
2. 第二天在选定的孔中加入500-10,000 ng/ml嘌呤霉素。
3. 每2天检查一次活性。
4. 培养10-14天。每3天更换一次含嘌呤霉素的培养基。
5. 该细胞类型应使用3-5天后导致完全细胞死亡的嘌呤霉素的最低浓度。

需要多少病毒？

有效转导任何给定细胞系所需的病毒量必须凭经验确定。为使客户更容易做到这一点，我们为客户提供了多种细胞系/类型的建议转导条件表以供参考。如果您的细胞系不包括在此表中，我们建议通过滴定病毒确定您的细胞所需的最合适病毒量。我们建议最初尝试在0.5-20倍的MOI范围内优化病毒。超出这个范围，慢病毒可能会对一些细胞系产生毒性。尽管如此，也有一些研究报告使用了极高浓度的MOI病毒（高达100倍）。通常这些极端MOI需要更高滴度的病毒，我们可以根据要求提供这类病毒。

如何筛选合并的shRNA资源库？

筛选时，重要的是要有多余的shRNA显示相同的表型，从而减轻脱靶效应的潜在并发症。使用LentiPlex合并库有五个主要步骤。

1. 嘌呤霉素筛选条件的优化
2. 转导效率的优化
3. 用Mission® LentiPlex shRNA合并库转导和筛选靶细胞
4. PCR扩增
5. 通过测序识别阳性命中

在您最喜爱的基因（YFG）上可以很容易找到所识别的TRC shRNA序列和相应基因靶标的信息。

如何筛选阵列shRNA文库？

筛选时，重要的是要有多余的shRNA显示相同的表型，从而减轻脱靶效应的潜在并发症。其他RNAi提供者可能会提供针对单个基因的较小shRNA合并库。然而，我们的研究表明，在基因水平上聚合会带来三个潜在的危险：(1)功能性或表型效应减弱，(2)产生更多假阳性导联，（3）不能排除可能的脱靶效应。

嘌呤霉素抗体哪里可以买到？

如果参考文献指出PAC抗体已被用于检测病毒整合，那么他们的实验室中应该已经制造了这种抗体。

与使用GFP的荧光分选相比，使用抗生素有哪些优势？

转导细胞的选择可以通过使用嘌呤霉素或FACS选择tGFP表达基因来完成。任何一种选择都是有效的。然而，对于完全纯转导细胞群，建议用嘌呤霉素进行选择。

在聚凝胺敏感细胞系中，有哪些替代品可供选择？

是的，有些细胞系可能发现聚凝胺有毒。一些实验室已经开始使用纤维连接蛋白替代。然而，聚凝胺多数时候只是增强敲低作用，可能并非完全必要。ExpressMag是一种聚凝胺的替代品，可以大大提高转导效率。如果细胞是悬浮细胞，某些版本的Sp感染也可能效果很好。

能否同时沉默多个基因靶点？

有几种方法可以尝试同时靶向多个基因，但要记住，所有的构建体都含有相同的选择标记（嘌呤霉素）。正因为如此，目前还没有一种明确的方法来确定哪些细胞同时获得了两种病毒类型。你可以用两个shRNA靶标的混合物转导，或者你可以做序列转导，即先用一个shRNA转导，第二天接着用另一个。筛选阳性的唯一方法是qPCR或其他分析方法（选择不够）。

可以获得多少拷贝/细胞？

答案不是一刀切的。有些细胞系需要较大剂量的病毒（感染复数）。许多研究人员的目标是每个细胞只插入一个拷贝，这必须根据经验确定每个细胞系的用量。我们已经验证了大量细胞，请参阅细胞列表。

转导时，是否最好减少我细胞上的培养基体积？

许多研究人员在进行转导时倾向于减少其细胞上的培养基体积，因为他们的细胞系不会受到不利影响。体积减小可以提高慢病毒在细胞上的总浓度，从而有可能提高转导效率。

shRNA的预期敲低持续时间是多长？

从理论上讲，shRNA的产生和敲低应该是永久的。我们在转导和培养超过1年的细胞中看到过稳定和永久的敲低。这些培养物是由单一抗性细胞生长而成（克隆选择）。我们看到一些没有经过克隆选择的细胞群随着时间的推移而发生变化，这有时也被解释为敲低变化。实际情况是，在异质细胞群中，敲低的影响各不相同。正如你所想象的那样，一些细胞的生长速度可能超过其他细胞，因此随着细胞培养群的变化，所观察到的敲低百分比也会随着时间的推移而变化。

如何看到细胞并让它感染shRNA？

我们有一个很好的载体，它能表达tGFP和U6驱动的shRNA，我们可以克隆任何TRC或客户派生的shRNA到其中。这个定制载体，以及许多其他载体，均可在我们改版的网站上找到。

如何用免疫组化方法追踪慢病毒载体-siRNA在细胞中的掺入？是否有针对部分病毒的抗体可供使用？？有没有类似GFP的报告基因或者类似Cy3的siRNA标记？还有其他方法可以用来证明慢病毒载体的掺入吗？

有很多方法可以验证shRNA已经融入到你的细胞中。每个MISSION®-TRC构建体都携带着嘌呤霉素抗性基因（PAC）。可以使用PAC抗体追踪细胞或使用嘌呤霉素选择细胞。存活的细胞可表达shRNA。也可以使用针对PAC基因的探针qRT-PCR追踪细胞。我们确实能够提供将细胞荧光可视化的报告基因对照品（MISSION® TurboGFP对照转导颗粒-SHC003V）。

能将shRNA汇集到同一个基因上吗？？

是的，您可以在基因、家族甚至基因组水平上汇集shRNA。事实上，我们可提供一个名为LentiPlex的全基因组混合库，可以随时使用。不过，不推荐较低水平的汇集（即在基因水平）。单一的、表现不佳的克隆可急剧改变表达和表型，可能导致假阴性结果。