细胞培养基础知识：细胞培养的安全注意事项

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

• 细胞培养实验室风险评估
• 细胞培养中的生物危害
• 转基因生物（GMO）
• 实验室消毒
• 细胞培养废弃物的弃置

细胞培养实验室风险评估

风险评估的主要目的是防止人员受伤，保护财产，并避免对个人和环境的伤害。在许多国家，法律要求进行风险评估。例如，英国的《英国职业健康与安全法案（1974年）》就是一个例子。欧洲共同体指令也涉及工作中的健康和安全。您可以访问欧洲职业安全与健康局，了解相关法规和标准，或者联系您的现场健康与安全代表。因此，必须在开始任何活动之前进行风险评估。风险评估包括两个要素：

1. 识别和评估风险。
2. 制定避免或最小化风险的方法。

对于动物细胞培养，风险水平取决于要使用的细胞系，并且基于细胞系是否可能对人类造成伤害。不同的分类如下：

• 低风险：非人类/非灵长类动物连续细胞系和一些表征良好的人类连续细胞系。
• 中等风险：表征不良的哺乳动物细胞系。
• 高风险：源自人类/灵长类动物组织或血液的原代细胞。- 具有内源性病原体的细胞系（精确分类取决于病原体）— 有关详情，请参阅ACDP指南†。- 实验感染后使用的细胞系，其分类取决于感染因子 — 有关详情，请参阅ACDP指南。

† 危险病原体咨询委员会（ACDP）（1995年）《根据危害和遏制类别对生物制剂进行分类》，第4版，HSE书籍，英国萨德伯里。于2013年对1995年文件进行了第五次更新。2013年发布了生物制剂批准清单的更新。

注意：美国卫生与人类服务部（疾病控制和预防中心）在其微生物和生物医学实验室生物安全（BMBL）文件（2009年）中发布了类似的清单。美国体系使用生物安全等级代替英国ACDP危害分组。

诸如欧洲认证细胞培养物保藏中心（ECACC）的培养物保藏中心将根据其风险评估建议给定细胞系所需的最低隔离度。对于大多数细胞系，适当的遏制水平是2级，需要2级微生物安全柜。然而，取决于要进行的操作类型以及是否计划使用较大的培养体积，可能需要增加到遏制水平3。对于源自HIV或人T-嗜淋巴细胞病毒（HTLV）患者的细胞系，需要3级遏制。遏制是降低风险的最明显手段。其他不太明显的措施包括限制人员和设备进出实验室。良好的实验室作业规范以及良好的工作台操作技术，例如确保工作区域整洁，试剂正确标记和存储，也都对降低风险和使实验室成为安全工作环境非常重要。通过避免快速移液、刮擦和倾倒，可以限制暴露于气溶胶​​或飞溅物质的风险。此外，建议在使用原代人体材料的实验室工作的人员接受乙型肝炎疫苗的接种。员工的培训以及书面标准操作程序和风险评估的使用也将减少潜在的伤害。ECACC提供了涵盖组织培养安全性基础的细胞培养培训课程。

细胞培养中的生物危害

对人类致病的病毒是细胞培养物最可能的生物危害之一。如果已知或怀疑感染对人类致病的某种试剂，应在适合于该试剂的遏制水平下处理细胞培养物。还应考虑其他潜在的生物危害。这些涉及细胞培养基的组分、其他外来试剂（例如污染支原体）和细胞产物，其中一些可以是具有药理学、免疫调节或致敏性质的生物活性分子。另外，修饰细胞（例如杂合细胞）、转化细胞和含有重组DNA的细胞的产生和使用也可以是危险的。这些操作可能潜在地导致出现修饰或再激活的病毒、新的融合/杂合蛋白（特别是在跨物种杂合中）、以及病毒或细胞癌基因的表达。实验室工作人员切勿培养源自其自己的身体或组织的细胞。

体外转化或基因改造如果被意外接种到供体中，可导致恶性疾病或不寻常的药理学活性蛋白的表达。因此，人类细胞应该从与实验工作无关的个体中获得。应根据下文“废物处置”一节中描述的方法处理生物危害废物。

转基因生物（GMO）

应严格控制和管理转基因生物（GMO）的产生和使用。大多数国家都有监管机构来确保转基因生物所带来的风险最小化。例如在英国，所有使用和/或生成转基因生物的工作机构都必须依法建立基因改造安全委员会（GMSC）。在开始任何工作之前，应将拟进行工作的提案提交该委员会审核，必要时还需获得健康与安全执行局（HSE）的批准。有一项关于转基因工作监管的欧洲指令。个体细胞培养用户和机构有责任确保遵守其业务所在国家当局制定的法规。

实验室消毒

设计用于对培养废弃物、工作台面和设备进行消毒/去污的方法，其是将危害风险降至最低的重要手段。使用浓缩的消毒剂时，请始终穿戴合适的个人防护装备(PPE)，如手套和护目镜。所选择的手套应可耐受待处理的物质，并符合欧洲标准EN374-3。制造商的图表有助于确定给定工作的最佳手套。主要消毒剂分为四类，它们的特点归纳如下：

酒精（如乙醇、异丙醇）

• 乙醇有效浓度：乙醇为70%，异丙醇为60-70%
• 它们的作用方式是脱水和固着。
• 对细菌有效。乙醇对绝大多数病毒有效，但对无包膜病毒无效
• 异丙醇对病毒无效

醛类（例如甲醛）

• 醛类是刺激物，由于致敏问题，它们的使用应受到限制。
• 只能在通风良好的地方使用。
• 甲醛用于熏蒸实验室。在装置中加热甲醛，使其蒸发，这样所有暴露的表面上都会被覆盖一层消毒剂。

注意：通常，醛类用于消毒和熏蒸目的会有危害。请咨询当地法规和安全顾问。

次氯酸盐（例如次氯酸钠）

• 次氯酸盐是良好的通用消毒剂
• 可抗病毒
• 腐蚀金属，因此不应用于金属表面，例如离心机。
• 易被有机物灭活，因此应每天新鲜制备。
• 对于一般的表面消毒，应使用1000 ppm，对于丢弃消毒移液器的垃圾桶，使用2500 ppm，对于组织培养废物和溢出物使用10,000 ppm。

注意：当使用甲醛熏蒸机柜或房间时，必须首先除去所有次氯酸盐，因为两种化学物质一起反应产生致癌产物。

细胞培养废弃物的弃置

每个雇主都负有“谨慎义务”来根据国家法律要求安全处置所有生物废物。下面列出了安全净化、处置组织培养废物的方式。管理所有实验室废物的最重要方面之一是定期弃置废弃物，不积累有害物。最好的做法是“勤清理”。不同形式的废物需要不同的处理。

• 组织培养废物（培养基）— 处置前在次氯酸盐（10,000 ppm）溶液中灭活至少2小时，然后用大量的水
• 污染的移液器应置于次氯酸盐溶液（2500 ppm）中过夜，然后通过焚烧处理。
• 固体废物，如烧瓶、离心管、污染的手套、组织等，应装入污染废物专用高强度袋子中，然后焚烧。
• 如果可能，废物应尽量焚烧而不是高压灭菌。
• 来自特别许可实验室的废物，例如处理转基因2级（GMO2）生物的实验室，则需要特殊处理和跟踪。