WB检测样本前处理：细胞裂解和蛋白提取

从细胞或组织（新鲜或冷冻）中提取蛋白质的所有步骤必须在2-8°C下进行。以下是用于制备蛋白质样品的一种常见裂解缓冲液的成分。访问计算器页面获取缓冲液及其他用于Western blotting溶液的配方列表。

用于蛋白质提取的RIPA缓冲液即用型溶液（货号：R0278）

• NaCl (货号：S3014) 150mM
  
• Triton X-100 (货号：T8787) 1%
  
• 脱氧胆酸钠(货号：D6750) 0.5%
  
• SDS (货号：74255) 0.1%
  
• Tris-HCl (货号：T1503) pH 8.0, 50 mM

蛋白酶抑制剂-不要在样品准备过程中丢失蛋白质

蛋白质提取实验方案步骤

1. 将含有细胞的培养皿中的培养基丢弃，用冰冷的PBS洗涤细胞。
   
2. 丢弃PBS，加入冰冷的裂解缓冲液。
   
3. 使用冷塑料细胞刮刀刮擦细胞。收集微量离心管中的细胞。
   
4. 将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
   
5. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从细胞悬液提取蛋白质

1. 将细胞悬液在4℃下以2,000 x g离心5-7分钟。细胞将聚集于试管底部，弃去上清液。
   
2. 向细胞沉淀中加入冰冷的PBS，并在4℃下以2,000 x g离心5-7分钟洗涤细胞。
   
3. 向细胞沉淀中加入冰冷的裂解缓冲液。将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
   
4. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从组织中提取蛋白质

1. 在冰上切割要研究的组织。将组织转移到圆底离心管，浸入液氮快速冷冻。
   
2. 对于5 mg组织，加入300 μL冰冷的裂解缓冲液，使用电动匀浆器均化。在均质化过程中另再添加300-600 μL裂解缓冲液。
   
3. 在4℃下搅拌内容物2小时。
   
4. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

均一化样品总蛋白质浓度

1. 取少量裂解物进行蛋白质估算测定。
2. 通过与标准样品比较确定未知样品的蛋白质浓度，确保将标准样品稀释到与未知样品相同的缓冲液中。蛋白质估算可以使用 考马斯蛋白质测定试剂（货号 27813）、BCA 测定、280nm吸光度。
3. 将适当体积的裂解物转移到微量离心管中，使得所有样品都含有相同的总蛋白质浓度。
   
4. 加入足够的冰冷裂解缓冲液，使所有裂解物具有相同的体积。

将样品与Laemmli上样缓冲液混合

以下是制备电泳样品所需的上样缓冲液的成分。

2X Laemmli上样缓冲液：

• 溴酚蓝（货号B5525） 0.004%
• 2-巯基乙醇 10%
• 甘油（货号G5516） 20%
• SDS（货号74255） 4%
• Tris-HCl（货号T1503） 0.125 M

1. 向一定量的细胞裂解物中加入等量的上样缓冲液。
   
2. 将上述混合物在95℃下煮沸5分钟。16,000 x g离心5分钟。
   
3. 这些样品可以在-20°C下储存，也可以用于进行凝胶电泳。