TRI Reagent^®实验方案

TRI Reagent^®有何作用？

TRI Reagent^®溶液（也以TRIzol的名称出售）是硫氰酸胍和苯酚的单相溶液混合物，可用于从人、动物、植物、酵母、细菌和病毒生物样品中分离DNA、RNA和蛋白质。其可抑制RNase活性。TRI Reagent^®用于匀浆提取RNA、DNA或蛋白质的生物样品。

操作流程

样品制备

1A. 组织：
在Polytron^®或其他合适的均质器中，在TRI Reagent（每50-100mg组织1ml）中均质化组织样品。

注意：如果需要最小量的DNA剪切，请使用松散型均质器，而不是Polytron（参见DNA分离，步骤3，注释b）。组织的体积不应超过TRI Reagent体积的10％。

1B.单层细胞：
直接在培养皿上裂解细胞。每10 cm²玻璃培养板表面积使用1 ml TRI Reagent。加入试剂后，应使用移液管抽吸细胞裂解液数次，以形成均质裂解物。

注意：TRI Reagent与塑料培养板不兼容。

1C.悬浮细胞：
通过离心分离细胞，然后通过重复移液使其在TRI Reagent中裂解。1 ml试剂足以裂解5–10 × 10⁶个动物、植物或酵母细胞或10⁷个细菌细胞。

注意：

• 如果样品的脂肪、蛋白质、多糖或细胞外物质含量高，例如肌肉、脂肪组织和植物的块茎部分，则可能需要 额外的步骤。均质化后，将匀浆12,000 × g、2-8℃离心10分钟以除去不溶物质（细胞外膜、多糖和高分子量 DNA）。上清液含有RNA和蛋白质。如果样品脂肪含量高，则应该除去水相表面上的一层脂肪物质。将澄清的上清液转移到新管中并继续进行步骤2。按照DNA分离步骤2和3从沉淀中回收高分子量DNA。
• 一些酵母和细菌细胞可能需要均化器。
• 将细胞在TRI Reagen中均质化或裂解后，可将样品在-70℃下储存长达1个月。

相分离：为确保核蛋白复合物完全解离，使样品在室温下静置5分钟。每ml TRI Reagent加入0.1ml 1溴-3氯丙烷或0.2ml氯仿（参见相分离，注释a和b）。紧紧盖住样品，剧烈摇动15秒，并在室温下静置2-15分钟。将所得混合物以12,000 × g、2-8℃离心15分钟。离心将混合物分成3个相：红色有机相（含有蛋白质），中间相（含有DNA）和无色上层水相（含有RNA）。

注意：

• 1-溴-3-氯丙烷的毒性低于氯仿，用它进行相分离降低了DNA污染RNA的可能性。⁴
• 用于相分离的氯仿不得含有异戊醇或其他添加剂。
• 关于从水相中分离Poly A⁺组分的信息，请参见附录I。

RNA分离或提取

1.将水相上清液转移到新管中，每ml用于制备步骤1中的TRI Reagent加入0.5ml 2-丙醇，混合。让样品在室温下静置5-10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。RNA沉淀在管的侧面和底部。

注意：将中间相和有机相储存在2-8°C，以备用于随后的DNA和蛋白质分离。

2.去除上清液，在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中至少加入1 ml 75％乙醇来洗涤RNA沉淀。涡旋样品，然后在2-8°C下以7,500 × g离心5分钟。

注意：

• 如果RNA颗粒漂浮，则以12,000 × g在75％乙醇中洗涤。
• 样品可以在2-8°C下在乙醇中储存至少1周，在-20°C下储存长达1年。

3.通过风干或真空将RNA沉淀短暂干燥5-10分钟。不要让RNA沉淀完全干燥，否则会大大降低其溶解度。请勿在真空（Speed-Vac®）下离心干燥RNA沉淀。向RNA沉淀中加入适量的甲酰胺、水或0.5％ SDS溶液。为了促进溶解，用微量移液管在55-60℃下反复吹打10-15分钟以混合。

注意：

• RNA的最终制备液中不含DNA和蛋白质。它应该具有≥1.7的A260 / A280比率。
• 组织的典型产率（mg RNA/mg组织）：肝脏、脾脏：6-10mg；肾脏：3-4mg；骨骼肌、脑：1-1.5mg；胎 盘：1-4 mg。
• 培养细胞的常见产量（mg RNA/106个细胞）：  上皮细胞，8-15 mg；成纤维细胞，5-7 mg。
• 琼脂糖凝胶中RNA的溴化乙锭染色显示两条主要条带：小（2 kb）和大（5 kb）核糖体RNA，低分子量 (0.1–0.3 kb) RNA，以及高分子量（7-15 kb）RNA的离散条带。

DNA分离或提取

1.小心地去除与中间相重叠的水相并丢弃。为了从中间相和有机相中沉淀DNA，在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中加入0.3ml 100％乙醇。倒置混合并在室温下静置2-3分钟。在2-8℃下以2,000 × g离心5分钟。

注意：在DNA沉淀之前去除剩余的水相是保证分离DNA质量的关键步骤。

2.去除上清液，保存在2-8°C，以备进行蛋白质分离。用0.1M柠檬酸三钠、10％乙醇溶液洗涤DNA沉淀两次。对每1 ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent使用1ml洗涤溶液。在每次洗涤期间，使DNA沉淀静置（偶尔混合）至少30分钟。在2-8℃下以2,000 × g离心5分钟。将DNA沉淀重悬于75％乙醇（每ml TRI Reagent1.5-2 ml）中，并在室温下静置10-20分钟。

注意：

• 重要提示：请勿缩短样品处于洗涤液中的时间。30分钟绝对是从DNA中有效去除苯酚所需的最短时间。
• 如果沉淀团有> 200 mg DNA或大量非DNA材料，则需要在0.1M柠檬酸三钠、10％乙醇溶液中额外洗涤。
• 悬浮在75％乙醇中的样品可以在2-8℃下储存数月。

3.在真空下将DNA沉淀干燥5-10分钟，并溶解于8mM NaOH中，用微量移液管反复缓慢移液混合。加入足量8mM NaOH，使最终DNA浓度为0.2-0.3 mg / mL（对于从50-70 mg组织或10⁷个细胞中分离的DNA，通常为0.3-0.6 ml）。这种温和的碱性溶液可确保DNA沉淀完全溶解。以12,000 × g离心10分钟，以除去任何不溶物质，并将上清液转移到新管中。

注意：

• 粘性上清液表明存在高分子量DNA。
• DNA的大小取决于均质化过程中施加的力。避免使用Polytron均质器。
• 溶解在8mM NaOH中的样品可以在2-8℃下储存过夜。如要长期储存，则将pH值调节至7至8之间，并补 EDTA（最终浓度1 mM）。
• 要确定DNA浓度，取一份等分试样，用水稀释，并测量A260。  对于双链DNA，1 A260单位/ml =50μg/ml
• 为了计算细胞数，假设人、大鼠和小鼠的10<sup>6</sup个二倍体细胞的DNA量分别等于7.1μg、6.5μg和5.8μg。
• 组织的常见产量（µg DNA/mg组织）：  肝脏、肾脏，3-4 µg；骨骼肌、大脑和胎盘，2-3 µg。
• 培养的人、大鼠和小鼠细胞的典型产率：5-7μg DNA/106细胞。

用PCR扩增DNA

溶于8mM NaOH后，用HEPES调节至pH 8.4（加入86μL 0.1M HEPES 游离酸/ml DNA溶液）。将样品（通常0.1-1μg）加入PCR混合物中，并执行PCR实验方案。

用限制酶消化DNA

用HEPES将DNA溶液的pH调节至限制酶消化所需的pH，或者针对1mM EDTA、pH 7-8透析样品。在最佳条件下使限制酶消化继续3-24小时。建议每1μg DNA使用3-5单位的酶。通常，80-90％的DNA被消化。

蛋白质分离

1.每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent，用1.5ml 2-丙醇，从苯酚-乙醇上清液（DNA分离，步骤2）沉淀蛋白质（参见注释）。使样品在室温下静默至少10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。

注意：对于某些样品，蛋白质沉淀可能难以溶解在1％ SDS（步骤3）中。使用下列步骤来解决这一问题：

• 在2-8℃下，更换3次0.1％ SDS，每次透析苯酚-乙醇上清液。
• 在2-8℃下以10,000 × g离心透析液10分钟。
• 澄清的上清液含有适用于Western Blotting的蛋白质。

2.弃去上清液，并在0.3M盐酸胍 / 95％乙醇溶液中洗涤沉淀团3次，每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent用2ml洗涤溶液。在每次洗涤期间，室温下将样品在洗涤溶液中储存20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。洗涤3次后，加入2ml 100％乙醇，并涡旋蛋白质沉淀。在室温下静置20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。

注意：悬浮在0.3 M盐酸胍 / 95％乙醇溶液或100％乙醇中的蛋白质样品可在2-8°C下储存1个月或在-20°C下储存1年。

3.在真空下干燥蛋白质沉淀5-10分钟。将沉淀团溶解在1％ SDS中，将微量移液管吸头置于溶液中，移动柱塞帮助溶解。在2-8℃下以10,000 × g离心10分钟，以除去任何不溶物质。将上清液转移到新管中。蛋白质溶液应立即用于Western blotting或储存在-20°C下。

故障排除指南

1.RNA分离：

A. 低产率可能是由于：

• 样品未完全均质化或裂解。
• 最终的RNA沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.65：

• 用于均质化的样品量可能太小。
• 均质化后，可能未让样品在室温下静置5分钟。
• 水相可能有酚相污染。
• 最终的RNA沉淀可能尚未完全溶解。

C. 如果RNA降解：

• 从动物身上取下组织后，可能没有立即处理或冷冻组织。
• 用于分离的样品或者已分离的RNA制备液可能被储存于-20°C下，而不是操作程序规定的-70°C下。
• 细胞可能已被胰蛋白酶消化而散开。
• 用于操作的水溶液或试管可能含有RNAse。
• 用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛的pH值可能<3.5。

D. 如果有DNA污染：

• 用于样品均质化的试剂量可能太小。
• 用于分离的样品可能含有有机溶剂（乙醇、DMSO）、强缓冲液或碱性溶液。

2.DNA分离：

A. 低产率可能是由于：

• 样品未完全均质化或裂解。
• 最终的DNA沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.70：

• 苯酚可能未从DNA制剂中充分除去。用0.1M柠檬酸三钠、10％乙醇溶液再洗一次DNA沉淀。

C. 如果DNA降解：

• 从动物身上取下组织后，可能没有立即处理或冷冻组织。
• 用于分离的样品可能被储存于-20°C下，而不是操作程序规定的-70°C下。
• 样品可能是用Polytron或其他高速均质器均质化的。

D.  如果有RNA污染：

• 在有机相和中间相中可能存在过多水相。
• DNA沉淀可能未用0.1 M柠檬酸三钠、10％乙醇溶液充分洗涤。

3.蛋白质分离：

A. 低产率可能是由于：

• 样品未完全均质化或裂解。
• 最终的蛋白质沉淀可能尚未完全溶解。

B. 如果蛋白质降解：

• 从动物身上取下组织后，可能没有立即处理或冷冻组织。

C. 如果PAGE显示条带变形：

• 蛋白质沉淀可能未经充分洗涤。

附录

I. I.Poly A+ RNA的分离RNA
用2-丙醇沉淀RNA后（RNA分离，步骤1），将沉淀溶解在聚A 结合缓冲液中，然后通过寡核苷酸dT纤维素柱，根据Aviv和Leder操作程序选择性地去除mRNA。³

II.分离的RNA用于RT-PCR

1.1. 修改操作程序，即在初始样品制备步骤1B中进行额外的离心。注释c进一步减小了TRI Reagent LS提取的RNA中DNA污染的可能性。

2.当RNA样品用于RT-PCR时，需要更完全地蒸发乙醇。这对于小体积样品（5-20​​μl）尤其重要，如果没有充分干燥，可能含有相对较多的乙醇。

参考文献

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126