溶壁酶的酶学测定

描述

本操作程序可用于使用面包酵母作为底物测定溶壁酶的活性。比浊测定法 [800 nm处的吸光度（A₈₀₀），光程 = 1cm] 基于以下反应：

单位定义：一个单位的溶壁酶在pH 7.5、25 ℃下，使用酵母悬液作为底物，在3 mL反应混合物中每分钟产生0.001 ΔA₈₀₀。

所需试剂和设备

• 1 M磷酸氢钾溶液（货号：P8709）
• 1 M磷酸氢二钾溶液（货号：P8584）
• 来自酿酒酵母的酵母（货号YSC1）

注意事项 — 有关有害物及其安全处理方法的信息，请参阅安全数据表。

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

磷酸盐缓冲液（67 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5，25 °C）— 制备100 mL：

1. 将1.33 mL 1 M磷酸二氢钾溶液（货号P8709）移液到合适的烧杯中。
2. 加入5.37 mL 1 M磷酸氢二钾溶液（货号P8584）。
3. 用超纯水稀释至100 mL。
4. 用1 M KOH调节至pH 7.5。

底物 [0.4％（w/v）面包酵母悬液（来自酿酒酵母的酵母）] —

1. 用研钵和研杵研磨适量的酵母（货号：YSC1），得到至少800 mg的粉末。研磨粉末的细度应在25-30目之间。

2. 用粉末在超纯水中制备4 mg/mL酵母悬液。

3. 搅拌溶液，搅拌速度尽量不产生涡旋。在室温下混合约1小时。
   注意：搅拌速度过高可能导致酵母细胞过早溶解。

4. 1小时后，停止搅拌，静置30分钟以使较大的沉淀物沉降。小心地将上部三分之二的上清液倒入新的烧杯中。去除较大的沉积物将在测定时使分光光度计读数的噪音最低。

5. 在运行测定之前必须检查确认底物浓度。

   a. 移取以下试剂到合适的比色皿中：

试剂	空白样(ml)	底物（mL）
超纯水	1.50	0.60
磷酸盐缓冲液	1.50	1.50
底物，第4步	–	0.90

   b. 测量酵母混合物的A₈₀₀与超纯水的比较。ΔA₈₀₀ [ΔA_800(底物) = A_800(底物) – A_800(空白)]必须在0.7 –1.0之间。如有必要，使用适量的酵母粉或超纯水调整吸光度。

6. 在整个测定过程中，在室温下缓慢混合底物（尽量减小涡旋）。该混合物可以稳定8小时。

酶溶液 — 制备10 mg固体/ml溶壁酶溶液。仅在使用前，制备二次稀释液以便校正的ΔA₈₀₀/min落在0.025和0.035之间。如果速率超出此范围，则适当二次稀释液，并重新执行上述步骤。

说明：

• 有些粗制的溶壁酶产品，可能需要15分钟以上时间才能溶解。进行1-15秒的短时超声处理有助于溶解酶而不影响酶活性。

• 如果校正的吸光度小于0.025，则增加酶的浓度，以使校正吸光度达到0.025-0.035。

• 如果校正的吸光度大于0.035，则减小酶的浓度，以使校正吸光度达到0.025-0.035。

操作流程

在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为：34 mM磷酸钾，~0.12％（w/v）面包酵母和25-35个单位溶壁酶。

1. 将下列试剂移至合适的容器中：

试剂	检测1（mL）	检测2（mL）	检测3（mL）	空白样(ml)
超纯水	0.55	0.55	0.55	0.60
磷酸盐缓冲液	1.50	1.50	1.50	1.50
底物	0.90	0.90	0.90	0.90

2. 倒置混合测试和空白比色皿，并平衡至25 ℃。然后加入酶溶液：

试剂	测试1 (mL)	测试2 (mL)	测试3 (mL)	空白 (mL)
酶溶液	0.050	0.050	0.050	–

3. 立即倒置混合空白和所有测试样品。按顺序执行此操作程序以捕获底物的稳定效果。记录A₈₀₀吸光度的降低~10分钟。

4. 在2分钟的时间段内，使用每个测试的最大线性速率获得ΔA₈₀₀/min。每个测试速率都需要使用空白样的相应时间范围进行校正。

5. 校正的ΔA₈₀₀/min必须介于0.025和0.035之间，才能使测定有效。如果速率超出此范围，则适当调节酶浓度，并重新执行上述步骤。

结果

计算

1.

式中：
df = 酶的稀释因子
0.001 = 根据单位定义在800 nm处的吸光度变化
0.050 = 反应中使用的酶溶液的体积（mL）

2.