己糖激酶的酶促检测

目标

建立己糖激酶酶促测定的标准化操作流程。

适用范围

本操作流程适用于大多数遵酶促测定糖激酶参数的产品¹。

定义

ATP =5'-三磷酸腺苷
ADP =5'-二磷酸腺苷
G-6-PDH =葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
β-NADP =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，氧化形式
β-NADPH =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原形式
6-PG = 6-磷酸-D-葡糖酸盐

反应

D-葡萄糖 + ATP ^己糖激酶 > D-葡萄糖-6-磷酸+ ADP
D-葡萄糖-6-磷酸 + β-NADP ^G-6-PDH >6-PG + β-NADPH

操作流程

条件：T = 25°C，pH = 7.6，A_340nm，光程 = 1 cm

方法：连续光谱法速率测定

试剂：

试剂 A：  50 mM三羟乙基胺缓冲液，pH 7.6、25 °C（缓冲液）.用去离子水和盐酸三羟乙基胺盐（货号T1502）配制100 mL溶液。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.6。

试剂B：555 mM D-葡萄糖溶液（D-葡萄糖）。利用试剂A和D-(+)-无水葡萄糖（货号G8270）配制10mL溶液。

试剂C：19 mM 5'-三磷酸腺苷溶液(ATP)。用去离子水和5'三磷酸腺苷二钠盐（货号A2383）配制10 mL溶液（新鲜配制）。

试剂D：100 mM 氯化镁溶液(MgCl₂)。用去离子水和氯化镁溶液（货号M1028）配制5 mL溶液。

试剂E：14 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐溶液，氧化形式(β-NADP)。用去离子水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐（货号N0505）配制10 mL溶液（新鲜配制）。

试剂F：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液 (G 6 PDH)。²临使用前，利用试剂A和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（货号G4134）配制125单位/mL的溶液。³

试剂G：己糖激酶酶溶液。临时用前，利用低温去离子水和纤维素酶配制中制备0.51.0单位/ml的溶液。）

测试方法：

    将下列试剂(mL)加入适宜的培养皿中：

	试样	空白样3
试剂A（缓冲液）	1.00	1.00
试剂B（D-葡萄糖）	1.00	1.00
试剂C（ATP溶液）	0.10	0.10
试剂D (MgCl2)	0.20	0.20
试剂E (β-NADP)	0.20	0.20
试剂F（G-6-PDH）	0.02	0.02

倒置混合并平衡至25 °C。使用合适的恒温分光光度计检监测A_340nm直至恒定。然后添加：

去离子水	------	0.05
试剂G（酶溶液）	0.05	------

   立即倒置混匀，并记录5分钟内的A_340nm增量。使用检测组和空白对照的最大线性率算出ΔA_340nm/分钟。

计算方法：

	单位/mL 酶 =	（Δa340nm/分钟 检测-ΔA340nm/分钟 空白对照）（2.57）（df)
		(6.22)(0.05)

   2.57 =反应体系总体积(mL)
df =稀释系数
6.22 =β-NADPH的在340nm处的毫摩尔消光系数
0.05 =所用的酶体积(mL)

	单位/mg 固体 =	单位/mL 酶
		mg 固体/mL 酶

	单位/mg 蛋白 =U	单位/mL 酶
		mg蛋白/mL酶

单位定义
在pH 7.6、25 °C条件下，一单位每分钟可磷酸化1.0 μmole的D-葡萄糖。

检测体系终浓度：
在2.57ml反应混合物中，终浓度为39mM三乙醇胺，216mM D-葡萄糖，0.74mM 5'-三磷酸腺苷，7.8mM 氯化镁，1.1mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，2.5单位葡萄糖6磷酸脱氢酶，和0.025-0.05单位的己糖激酶。

注意

1. 该方法不能用于测定己糖激酶（货号H3779）、附着于珠状琼脂糖的不溶性己糖激酶（货号H2005）、附着于聚丙烯酰胺的不溶性己糖激酶（货号H8254）。
   
2. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶单位定义：在pH为 7.4、25 °C、存在β-NADP的条件下，一单位每分钟可将1.0μm的D-葡萄糖6-磷酸氧化成6-磷酸-D-葡萄糖酸盐。
   
3. 其他类型的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可能含有不同量的己糖激酶杂质。  这可能导致高空白率，因此，G-6-PDH必须具有较低的己糖激酶杂质。

参考文献

1. Bergmeyer H, Grassl M, Walter H. 1983. in Methods of Enzymatic Analysis. (Bergmeyer, H.U. ed). 3(II):222-223.