qPCR条件优化
QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。
优化了测定后，重要的是验证反应效率。在报告和比较测定方案时，此处信息非常重要。在本文的实验方案示例中，比较了在广泛和狭窄的cDNA浓度动态范围上的测定效率。在实践中，通常根据样品的预期目标范围来选择一个单个测试范围，因此可以根据实验要求调整给定的实验方案。在本文的示例中，使用10倍和2倍连续稀释液计算效率。标准曲线应包含目标基因的预期表达范围。注意，使用ReadyScriptt®RT试剂盒时，cDNA产量与RNA输入的比例是线性的，因此如果使用RT-qPCR系统的话，可通过下列操作将本文的实验方案改编成适用于那个系统的：1）稀释RNA，并运行RT反应；2）然后在每个得到的cDNA样品上运行qPCR（相关示例请参见）。 然而，情况并非总是如此，并不适用于所有逆转录试剂盒或实验方案。在将此实验方案改编用于替代试剂盒之前，应进行验证。
设备
- 定量PCR仪器
- PCR设置的层流罩（选购件）
试剂
- 用作标准曲线模板（例如cDNA、gDNA或合成模板）的DNA
- KiCqStart SYBR®Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，参见
表 P4-6)。 - PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
- 用于测试基因的正向和反向引物（10 μM储备）。
| 热启动预混液 (Taq，Buffer，dNTPs，参考燃料，MgCl2) | |||
|---|---|---|---|
| KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ （货号 KCQS00) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (货号KCQS01) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 带ROX （货号 KCQS02) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 用于 iQ （货 KCQS03) |
| 兼容仪器： | 兼容仪器： | 兼容仪器： | 兼容仪器： |
| Bio-Rad CFX384™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 5700 | Bio-Rad iCycler iQ™ |
| Bio-Rad CFX96™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 7000 | Bio-Rad iQ™5 |
| Bio-Rad MiniOpticon™ | Fast Applied Biosystems ViiA 7 | Applied Biosystems 7300 | Bio-Rad MyiQ™ |
| Bio-Rad MyiQ™ | Stratagene Mx3000P® | Applied Biosystems 7700 | |
| Bio-Rad/MJ Chromo4™ | Stratagene Mx3005P™ | Applied Biosystems 7900 | |
| Bio-Rad/MJ Opticon 2 | Stratagene Mx4000™ | Applied Biosystems 7900 HT Fast | |
| Bio-Rad/MJ Opticon® | Applied Biosystems 7900HT | ||
| Cepheid SmartCycler® | Applied Biosystems StepOnePlus™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex | Applied Biosystems StepOne™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s | |||
| Illumina Eco qPCR | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q | |||
| Roche LightCycler® 480 | |||
耗材
- 无菌过滤器移液管吸头
- 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
- PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
• 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）
• 孔板
- 96孔板 (Z3749038)
- 384孔板 (Z374911)
• 孔板密封
- ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)
本方案注意事项
- 使用随机引发或oligo-dT方法生成cDNA（参见标准逆转录实验方案（两步法））。稀释RT产物以制备标准曲线（作为示例给出1:2和1:10）。也可以稀释RNA，而且可以使用ReadyScript® 试剂盒从每个稀释液中合成cDNA，或者通过稀释RNA，采用逆转录实验方案（一步SYBR® Green I 染料检测）和逆转录实验方案（一步探针检测）中的一步RT-qPCR法。另外，可以替换DNA模板，使得预期的Cq范围在Cq15至Cq38内。
- 对连续稀释液的每个浓度都重复进行反应。
方法
1. 按表P16-40制备足以进行40次反应的qPCR预混液。只进行32次反应，额外
的液体作为移液出错时备用（表P16-41）。
| 试剂 | 每次 单次20 μL反应的体积 (μL) | 40次 反应的体积（μL） |
|---|---|---|
| 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ | 10 | 400 |
| 正向引物 (10 μM) | 0.9 | 36 |
| 反向引物 (10 μM) | 0.9 | 36 |
| PCR级纯水 | 3.2 | 128 |
2. 2. 对DNA进行一系列1:10和1:2稀释，每个系列覆盖7个稀释点（见表P16-41，DNA稀释板布局）。
3. 向已标识好的孔中加入5 μL的适当的模板稀释液（参见表P16-41，DNA稀释板布局）。
| DNA稀释板布局 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 板 的列号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 板的其余部分 |
| A | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| B | 0.1 | 0.1 | 0.5 | 0.5 | |
| C | 0.01 | 0.01 | 0.25 | 0.25 | |
| D | 0.001 | 0.001 | 0.125 | 0.125 | |
| E | 0.0001 | 0.0001 | 0.0625 | 0.0625 | |
| F | 0.00001 | 0.00001 | 0.03125 | 0.03125 | |
| G | 0.000001 | 0.000001 | 0.015625 | 0.015625 | |
| H | NTC | NTC | NTC | NTC | |
4. 每孔加入15 μL预混液（见表P16-41）。
5. 给试管盖上盖子，或密封好板子，并贴上标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测
光路。）
6. 根据以下两步方案操作样品。重复执行第1-2步40次。接着
用标准解离曲线分析进行扩增。
| 循环条件 | 温度 (°C) | 时间（秒） |
|---|---|---|
| 初始变性 / 热启动 | 95 | 30 |
| 步骤1-2重复40个循环 | ||
| 第1步 | 95 | 5 |
| 第2步 | 60 | 30 |
说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。
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