寡核苷酸退火实验方案

• 缩写：
• DNA / RNA退火设备和耗材
• DNA / RNA退火方法
• DNA退火缓冲液配方

本实验方案用于两条序列互补的单链寡核苷酸的退火反应（图1）。加热后冷却有助于杂交反应的进行。

图 1. 退火反应示例图。加热“打破”了所有的氢键，从而破坏了每个寡核苷酸内的全部二级结构。随后，缓慢的冷却促进了杂交反应，最终在互补的序列间形成新的氢键。

寡核苷酸退火实验方案的定义/缩写

EDTA：乙二胺四乙酸

NaCl：氯化钠

Trizma^® 碱：Tris（三羟甲基氨基甲烷）的商名

Oligo：寡核苷酸或寡聚物的缩写。寡核苷酸是短单链DNA或RNA分子，必须对其进行退火（加热或解链），才可与适当的互补DNA或RNA链结合并形成双链。

DNA退火：本页讨论了所有寡核苷酸的退火过程。有时将退火也泛称为DNA退火——即使该过程也适用于RNA。退火是加热和冷却两条具有互补序列的单链寡核苷酸的过程。热量会破坏所有氢键，而冷却则会在序列之间形成新的键。

DNA / RNA退火设备和耗材

• 恒温槽或热循环仪
• 2 mL 离心管
• 移液器吸头
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA（货号E9884）
• NaCl（货号S3014）
• Trizma^®碱（货号93362）
• 两条序列互补的单链寡核苷酸

DNA / RNA退火方法

该退火反应分为两个主要的步骤：1）溶解，2）使用恒温槽或者热循环仪退火。

Oligo 溶解

尽管每种寡核苷酸都是已知量的，我们仍然建议使用分光光度计进行验证， 这可以保证加入反应的每种寡核苷酸是等量的。

• 将每种寡核苷酸溶解在一定体积的退火缓冲液（请参阅补充说明）中使得浓度相同。
• 每种寡核苷酸溶液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍。

示例

双链寡核苷酸目标浓度为50 µM。

1. 寡核苷酸1：标注OD值为10.55（312.6 µg, 49.9 nmol），使用分光光度计验证OD值。
2. 寡核苷酸2：标注OD值为9.04（279.7 µg, 45.9 nmol），使用分光光度计验证OD值。
3. 由于每种寡核苷酸原液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍，因此，每种原液的浓度需要达到100 µM。
   1. 对于寡核苷酸1，需添加 49.9 x 10 = 499 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。
   2. 对于寡核苷酸2，需添加 45.9 x 10 = 459 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。

*以上为配制100 µM溶液的简单计算方法，仅作为示例。如需了解更多关于不同寡核苷酸浓度的计算，请参阅“处理指南和稳定性”。

Oligo退火

恒温槽

1. 在离心管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
2. 将离心管于95 °C培养5 min。
3. 将离心管置于室温缓慢冷却（应<60 min）。

热循环仪

相对于恒温槽，热循环仪的稳定性更好。

1. 在PCR管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
2. 使用下面的温度设定程序：
   1. 加热至95 °C并保持2 min。
      
   2. 在45 min内冷却至25 °C 。
      
   3. 冷却至4 °C 以短期保存。
3. 对PCR管短时离心并弃去上层水分。

在恒温槽或者热循环仪操作后，得到的双链寡核苷酸可以用于后续操作或者用于保存。更多关于保存核苷酸的信息，请参阅“处理指南和稳定性”。

DNA退火缓冲液配方

所有缓冲液均采用Milli-Q^®纯水配制。

退火缓冲液组分 (1X)

• 10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

连接酶缓冲液组分 (1X)

此缓冲液通常用于T4 DNA连接酶。

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

激酶缓冲液组分 (1X)

此缓冲液通常用于T4多核苷酸激酶。

• 70 mM Tris-HCl, pH 7.6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT