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一般描述
cDNA末端快速扩增(RACE)是一种用于从部分已知序列快速获得全长cDNA的常用技术。[1]5′/3′ RACE试剂盒包含转录物逆转录酶和重组末端转移酶。转录子逆转录酶可转录全长cDNA，用于高达14 kb的55′或3′ cDNA片段的高灵敏度和快速扩增。其具有热稳定性（高达+ 65°C），适用于具有高二级结构的高GC含量模板。使用转录物逆转录酶可以实现高灵敏度，从而实现高效的cDNA合成和长RACE产物的获得。重组末端转移酶用于将同聚A尾添加至cDNA的3′末端。[2]poly(A)+尾可降低oligo(dT)-锚定引物所产生的不适当截短的可能性，并且可以克服相较于G / C来说较弱的A / T杂交问题.此外，在oligo(dT)-锚定引物可以与内部位点进行杂交并且截短扩增产物之前，需要一段更长的A残基片段。使用基因特异性引物和oligo(dT)-锚定引物通过PCR扩增加尾cDNA。使用嵌套的特异性引物和PCR锚定引物，通过第二次PCR进一步扩增所获cDNA，从而将RACE产物克隆到合适的载体中以用于后续研究。
特异性
热灭活：终端转移酶：70°C，10分钟
转录物逆转录酶：85°C，5分钟
转录物逆转录酶：85°C，5分钟
应用
特点和优势
- 强大的性能: 重组转录物逆转录酶能够在困难的二级RNA结构区域上向前移动。
- 方便：RNA的5′ 或3′ 末端的功能和表达研究可以用相同的试剂盒进行。
- 可靠： 使用重组末端转移酶获得的dA加尾cDNA降低了不当截短的概率。
- 可重复：具有非3′ dT的寡聚dT-锚定引物能够确保与poly (A)尾的内端正确结合。
- 产生长片段：使用转录物逆转录酶生成长达14kb的cDNA。
对照反应包括使用对照引物neo1/rev将对照RNA转录成第一链cDNA。使用对照引物neo2/rev和neo3/for进行cDNA的扩增，以获得157bp的PCR产物。使用dATP对纯化的cDNA进行加尾。用寡聚dT-锚定引物和对照引物neo2/rev进行加尾cDNA的扩增，以获得293bp的PCR产物。
包装
1个试剂盒包含12个组分
其他说明
仅用于生命科学研究。不用于诊断操作。
仅试剂盒组分
产品编号
说明
- cDNA Synthesis Buffer 5x concentrated
- Transcriptor Reverse Transcriptase 20 U/μl
- Deoxynucleotide Mix
- dATP, pH 7.5 (20 °C)
- Reaction Buffer 10x concentrated
- Terminal Transferase, recombinant
- Control neo-RNA 1 ng/μl
- Oligo dT-Anchor Primer
- PCR Anchor Primer
- Control Primer neo1/rev primer 12.5 μM
- Control Primer neo2/rev primer 12.5 μM
- Control Primer neo3/for primer 12.5 μM
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储存分类代码
12 - Non Combustible Liquids
WGK
WGK 1
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商品
In addition to the troubleshooting provided in the product manual, most probably the efficiency of the tailing reaction performed by Terminal Transferase could be impaired. This could occur due to several reasons (which will not only affect the control reaction, but 5′ RACE in general):
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