Przewodnik rozwiązywania problemów w chromatografii powinowactwa znakowanych białek

Poniższy przewodnik rozwiązywania problemów dotyczy problemów wspólnych dla większości produktów do oczyszczania omówionych w tym rozdziale, a także problemów specyficznych dla konkretnej metody. W tym drugim przypadku wskazany jest odpowiedni produkt.

W celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rozwiązywania problemów związanych z produktem, należy zapoznać się z instrukcjami dołączonymi do produktu.

W celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rozwiązywania problemów związanych z produktem, należy zapoznać się z instrukcjami dołączonymi do produktu.

Problem	Możliwa Przyczyna	Rozwiązanie
	Kolumna lub studzienki płytki zostały zatkane. LUB Płyn nie został całkowicie usunięty podczas wirowania (kolumny SpinTrap). LUB Przepływ jest zbyt wolny (kolumny GraviTrap).	Obecne są pozostałości komórek.	Zoptymalizuj wstępną obróbkę próbki przed następnym załadowaniem próbki. Odwiruj i/lub przepuść próbkę przez filtr 0,22 lub 0,45 µM. Oczyścić podłoże chromatograficzne zgodnie z Załącznik 1 (Charakterystyka produktów Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON Superflow i nienaładowanej IMAC Sepharose). Jeśli czyszczenie w miejscu (CIP) nie powiedzie się, należy wymienić nośnik/spakowaną kolumnę. Spróbuj użyć surowej kolumny HisTrap FF lub surowej kolumny HiTrap TALON.
Próbka jest zbyt lepka z powodu zbyt wysokiego stężenia materiału lub obecności dużych cząsteczek kwasu nukleinowego (o czym może świadczyć zwiększone ciśnienie wsteczne).		Zwiększyć wydajność mechanicznego rozbijania komórek (np, wydłużyć czas sonikacji). Przechowywać próbkę na lodzie, aby uniknąć spienienia i przegrzania, ponieważ może to spowodować denaturację docelowego białka. Zwiększyć rozcieńczenie pasty komórkowej przed lizą lub rozcieńczyć po lizie, aby zmniejszyć lepkość.Jeśli lizat jest bardzo lepki z powodu wysokiego stężenia kwasu nukleinowego gospodarza, należy kontynuować rozbijanie komórek do momentu zmniejszenia lepkości i/lub dodać dodatkową dawkę DNazy i Mg2+  (DNaza I do 5 µg/ml, Mg2+  do 1 mM) i inkubować na lodzie przez 10 do 15 minut. Zamrażanie/rozmrażanie nieklarowanego lizatu może zwiększyć wytrącanie i agregację. Mechaniczna liza rozmrożonego lizatu może zapobiec zwiększonym problemom z przeciwciśnieniem podczas ładowania kolumny. Jeśli oczyszczanie zostało przeprowadzone w temperaturze 4°C, przenieś je do temperatury pokojowej, jeśli to możliwe (lepkość próbki zmniejsza się w temperaturze pokojowej).Zmniejszyć szybkość przepływu podczas ładowania próbki.
	Białko jest trudne do rozpuszczenia lub wytrąca się podczas oczyszczania.	Najpierw należy sprawdzić odpowiednie warunki rozpuszczalności; zmienić pH, siłę jonową, stężenie białka, detergent lub inne dodatki, które mogą wpływać na rozpuszczalność białka.Można stosować następujące dodatki: do 1% NP-40, 1% CHAPS, 1,0 M NaCl, 20% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol, 1 do 3 mM DTT lub DTE (możliwe jest użycie do 5 mM, ale zależy to od próbki i jej objętości). Delikatnie mieszać przez 30 minut, aby wspomóc solubilizację znakowanego białka Należy pamiętać, że NP-40 (ale nie Tween™-20 w stężeniu do 1%) ma wysoką absorbancję przy 280 nm. Ponadto, detergenty nie mogą być łatwo usunięte przez wymianę buforu. Ciała inkluzyjne: białko może być zwykle rozpuszczane (i rozwijane) przy użyciu popularnych denaturantów, takich jak 4 do 6 M Gua-HCl, 4 do 8 M mocznik lub silne detergenty. Zobacz Rozdział 10, Obsługa ciał inkluzyjnych.
Brak lub niska wydajność białka znakowanego histydyną w oczyszczonych frakcjach.	Brak białka znakowanego histydyną w materiale wyjściowym.	Weryfikuj obecność białka znakowanego histydyną w materiale wyjściowym, np, poprzez Western blotting.
	Jony niklu są usuwane.	Zmień na Ni Sepharose excel, jeśli próbka powoduje usuwanie, na przykład, jeśli białka znakowane histydyną są wydzielane do supernatantów hodowli komórek eukariotycznych.Ni Sepharose excel, HisTrap excel i His Mag Sepharose excel mają wyjątkowo silnie związane jony niklu.
	Warunki elucji są zbyt łagodne (białko znakowane histydyną nadal związane).	Elucja ze zwiększeniem stężenia imidazolu lub zmniejszeniem pH.
	Białko wytrąciło się w kolumnie lub studzienkach.	Zmniejsz ilość próbki lub zmniejsz stężenie białka przez elucję liniowym gradientem imidazolu zamiast etapami imidazolu.Wypróbuj detergenty lub zmień stężenie NaCl.
	Występują niespecyficzne oddziaływania hydrofobowe lub inne.	Dodaj niejonowy detergent do buforu elucyjnego (np, 0,2% Tween-20) lub zmień stężenie NaCl.
	Niska wydajność eluowanego białka podczas ładowania wysoce nieklarownej próbki.	Klaruj próbkę przed załadowaniem na kolumny lub do studzienek. Wysoki poziom białek gospodarza i innych cząstek może zakłócać wiązanie białka docelowego. Rozważ użycie surowej kolumny HisTrap FF lub surowej kolumny HiTrap TALON.
Białko znakowane histydyną nie jest całkowicie eluowane.	Elucja z większą objętością buforu elucyjnego i/lub zwiększenie stężenia imidazolu.
Białko znakowane histydyną jest eluowane podczas ładowania/mycia próbki.	Stężenie imidazolu w próbce i/lub buforze wiążącym jest zbyt wysokie.	Zmniejsz stężenie imidazolu. Należy pamiętać, że imidazol zwykle nie jest wymagany w próbce i buforze wiążącym dla TALON Superflow i Ni Sepharose excel.
	Znacznik histydynowy może być niewystarczająco wyeksponowany.	Przeprowadź oczyszczanie rozwiniętego białka w moczniku lub Gua-HCl, tak jak w przypadku ciał inkluzyjnych, aby sprawdzić, czy znacznik jest ukryty. Aby zminimalizować rozcieńczenie próbki, można dodać stały mocznik lub Gua-HCl. Rozważ znacznik His-10 lub dodaj łącznik między znacznikiem a białkiem docelowym, aby zwiększyć ekspozycję.
	Skład buforu/próbki nie jest optymalny.	Sprawdź pH i skład próbki i buforu wiążącego. Upewnij się, że czynniki chelatujące lub silnie redukujące nie są obecne w próbce w zbyt wysokim stężeniu. Zwiększ pojemność buforową buforu płuczącego i elucyjnego, aby uniknąć spadku pH spowodowanego przez imidazol.
	Znak histydyny został utracony.	Sprawdź sekwencję konstruktu na Western blot lub ekstrakcie przy użyciu przeciwciała anty-His.
	Czas inkubacji jest zbyt krótki.	Zmniejsz szybkość przepływu lub wydłuż czas inkubacji próbki w studzienkach/partii lub użyj niższej prędkości wirowania/próżni (kolumny SpinTrap i MultiTrap).
	Zanieczyszczenia mogą mieć wysoką zdolność do wiązania niektórych jonów metali.	Dla odpowiednich formatów (tj, wstępnie zapakowanych kolumn HisTrap), połącz dwie lub trzy kolumny razem lub zmień kolumnę na większą.
	Pojemność została przekroczona.	Dla odpowiednich formatów (tj, wstępnie zapakowanych kolumn HisTrap), połącz dwie lub trzy kolumny razem lub zmień kolumnę na większą.
Białko znakowane histydyną znajduje się w pelecie.	Sonikacja może być niewystarczająca.	Rozerwanie komórek może być sprawdzone przez badanie mikroskopowe lub monitorowane przez pomiar uwalniania kwasów nukleinowych przy A260. Dodanie lizozymu (do 0,1 objętości 10 mg / ml roztworu lizozymu w 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) przed sonikacją może poprawić wyniki. Unikaj spieniania i przegrzewania, ponieważ może to spowodować denaturację docelowego białka.
	Białko zostało zaadsorbowane na szczątkach komórek podczas ekstrakcji i utracone podczas klaryfikacji.	Zmień warunki ekstrakcji (pH, siła jonowa, próba solubilizacji detergentem).
	Białko może być nierozpuszczalne (ciała inkluzyjne).	Białko można zwykle rozpuścić (i rozwinąć) z ciał inkluzyjnych przy użyciu powszechnie stosowanych denaturantów, takich jak 4 do 6 M Gua-HCl, 4 do 8 M mocznik lub silne detergenty. Zobacz Rozdział 10, Obsługa ciał inkluzyjnych.
Elucja białka nie jest czysta (wiele pasm na SDS-PAGE).	Proteazy częściowo zdegradowały znakowane białko.	Dodaj inhibitory proteazy (ostrożnie używaj EDTA).
	In vivo nieprawidłowości biosyntezy białka, np, przedwczesne zakończenie translacji.	Zmień warunki fermentacji i indukcji. Rozważ zmianę szczepu gospodarza lub gospodarza w celu przezwyciężenia problemów z tendencyjnością kodonów.
	Zanieczyszczenia mają wysokie powinowactwo do jonów metali.	Elucja ze stopniowym lub liniowym gradientem imidazolu.Przemyć przed elucją buforem wiążącym zawierającym tak wysokie stężenie imidazolu, jak to możliwe, bez powodowania elucji znakowanego białka. Wypróbuj TALON Superflow dla wysokiej czystości lub przetestuj przy użyciu innego jonu metalu na sefarozie IMAC.Drugi etap chromatografii, taki jak SEC, może być konieczny.
	Zanieczyszczenia są związane ze znakowanym białkiem, np, chaperonem dołączonym do białka docelowego.	Dodaj detergent i/lub środki redukujące przed sonikacją komórek. Zwiększ poziom detergentu (np. do 2% Tween 20) lub dodaj glicerol (do 20%) do buforu płuczącego, aby zakłócić niespecyficzne interakcje. Zwiększ stężenie imidazolu lub zmień jon metalu używany do oczyszczania. Zwiększ stężenie chlorku sodu do 500 mM w buforach.
	Niezwiązany materiał został niewystarczająco usunięty przez etap płukania.	Powtórz etap płukania po zastosowaniu próbki, aby uzyskać optymalną wydajność i czystość.
Niepożądane pęcherzyki powietrza utworzyły się podczas korzystania z systemu chromatograficznego.	Nieklarowne lizaty mogą powodować zwiększone tworzenie się pęcherzyków powietrza podczas oczyszczania.	Zapobiec temu może dołączony ogranicznik przepływu w systemie chromatograficznym za kolumną i komórkami przepływu detektora. Jeśli ogranicznik przepływu jest podłączony, ważne jest, aby zmienić limit ciśnienia na 0,5 MPa (5 barów) w systemie ÄKTA (gdzie kolumna i ogranicznik przepływu dają ciśnienie odpowiednio 0,3 MPa i 0,2 MPa).
MultiTrap: Wyciek roztworu jest obserwowany po usunięciu folii.		Dodaj 500 µL wody dejonizowanej dwukrotnie przed dodaniem buforu wiążącego do studzienek. Usunąć roztwór pomiędzy dodawaniem za pomocą wirowania lub próżni.