Oczyszczanie przy użyciu nośników do chromatografii opartych na białku A

Co to jest białko A?

Białko A pochodzi ze szczepu Staphylococcus aureus  i zawiera pięć regionów, które wiążą się z regionem Fc IgG. Jako ligand powinowactwa, białko A jest sprzężone z sefarozą^® dzięki czemu regiony te mogą swobodnie się wiązać. Jedna cząsteczka sprzężonego białka A może wiązać co najmniej dwie cząsteczki IgG.

Zarówno natywne białko A (n-białko A), jak i ligandy rekombinowanego białka A (r-białko A) są dostępne w firmie Cytiva. Cząsteczki te mają podobną specyficzność dla regionu Fc IgG, ale rekombinowane białko A zostało zaprojektowane tak, aby zawierało C-końcową cysteinę, która umożliwia jednopunktowe sprzężenie, gdy białko jest sprzężone z sefarozą, co zapewnia wyższą zdolność wiązania. Oprócz dobrze znanego powinowactwa do regionu Fc IgG, białko A ma również powinowactwo do niektórych wariantów regionu Fab, a zatem pożywki do chromatografii białka A mogą być w niektórych przypadkach stosowane do oczyszczania fragmentów Fab i F(ab´)2. Nośniki do chromatografii Protein A Sepharose^® firmy Cytiva mają również znacznie wyższą zdolność wiązania niż nośniki do chromatografii Protein G Sepharose^® i dlatego są preferowanym wyborem do wychwytywania przeciwciał monoklonalnych w procesach na skalę przemysłową (patrz rozdział 7). nProtein A Sepharose^® 4 Fast Flow jest produkowana bez użycia składników pochodzenia zwierzęcego. rBiałko A jest produkowane w E. coli i podczas zwalidowanych procesów fermentacji i oczyszczania nie stosuje się etapu powinowactwa ludzkich IgG, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia ludzkimi IgG.

Podłoże chromatograficzne Protein A Sepharose^® High Performance zapewnia ostrzejsze piki elucji i bardziej skoncentrowaną elucję przeciwciał w porównaniu z podłożem Protein A Sepharose^® 4 Fast Flow. Jednak mniejszy rozmiar kulek w matrycy Sepharose^® High Performance w porównaniu z matrycą Sepharose^® 4 Fast Flow prowadzi do zwiększonego przeciwciśnienia na kolumnie. Większy rozmiar kulek Sepharose^® 4 Fast Flow pozwala na wyższe natężenie przepływu, co jest niezbędne przy skalowaniu oczyszczania.

Białko A vs. Podłoża do chromatografii z białkiem G

Podłoża do chromatografii z białkiem A są często lepszym wyborem niż podłoża z białkiem G do izolacji niektórych podklas IgG lub do usuwania, na przykład, międzygatunkowych zanieczyszczeń IgG z końskiej lub płodowej surowicy cielęcej. Chociaż IgG jest główną ludzką immunoglobuliną, wykazano również, że niektóre inne typy wiążą się z białkiem A (patrz IgA i IgM w sekcji Oczyszczanie innych klas przeciwciał  w dalszej części tego rozdziału).

Siła wiązania białka A z IgG zależy od gatunku źródłowego immunoglobuliny. Dynamiczna zdolność wiązania zależy od siły wiązania i czynników takich jak szybkość przepływu podczas nanoszenia próbki.

Należy wziąć pod uwagę wyciek ligandów ze środowiska chromatografii powinowactwa, zwłaszcza jeśli stosowane są trudne warunki elucji. Wielopunktowe przyłączenie białka A do Sepharose^® skutkuje bardzo niskim wyciekiem ligandu w szerokim zakresie warunków elucji. Usunięcie zanieczyszczeń ligandem można osiągnąć poprzez polerowanie przy użyciu SEC lub IEX.

Różne opcje oczyszczania dla nośników chromatograficznych Protein A Sepharose^® podsumowano w Tabeli 3.4. Tabela 3.5 opisuje typowe warunki wiązania i elucji dla podłoży chromatograficznych Protein A Sepharose^® .

Tabela 3.4 Opcje oczyszczania IgG przy użyciu nośnika do chromatografii białkowej A Sepharose®

Produkt	Format lub rozmiar kolumny	Pojemność wiązania (mg IgG/ml podłoża)	Opis
nProtein A Sepharose® 4 Fast Flow	5 mL 25 mL	Approx. 30 (człowiek)	Dostarczana jako zawiesina do pakowania w np, Kolumny XK i Tricorn; używane do skalowania oczyszczania.
Białko A HP MultiTrap™	Płytki 96-dołkowe	Około. 20 (człowiek)	Do oczyszczania IgG na małą skalę, badań przesiewowych różnych konstruktów białkowych, optymalizacji warunków buforowych, wzbogacania białek przez immunoprecypitację.
Białko A HP SpinTrap™	100 μl Kolumny spinowe	Około 20 (człowiek)	Do oczyszczania IgG i fragmentów na małą skalę, wzbogacanie białek przez immunoprecypitację.
HiTrap™ Protein A HP	Kolumny 1 mL, 5 mL	Około 20 (człowiek)	Oczyszczanie IgG i fragmentów na skalę laboratoryjną. Zapakowane kolumny o pojemności 1 ml lub 5 ml można łączyć szeregowo w celu ułatwienia skalowania.
rProtein A Sepharose® Fast Flow	5 mL 25 mL	Approx. 50 (człowiek)	Dostarczana jako zawiesina do pakowania w np, Kolumny XK i Tricorn; używane do skalowania oczyszczania. Wyższa zdolność wiązania niż nProtein A Sepharose® 4 Fast Flow.
rProtein A GraviTrap™	1 mL Kolumny grawitacyjne	Około. 50 (człowiek)	Szybkie i wydajne ręczne oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych.
rProtein A/ Protein G GraviTrap™	1 mL kolumny grawitacyjne	Około. 35 mg IgG/kolumnę (człowiek)	Szybkie i wydajne ręczne oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych.
HiTrap™ rProtein A FF	Kolumny 1 mL, 5 mL	Około 50 (człowiek)	Oczyszczanie IgG, fragmentów i podklas na skalę laboratoryjną. Wstępnie zapakowane kolumny o pojemności 1 ml lub 5 ml można łączyć szeregowo w celu zwiększenia skali. Zwiększona zdolność wiązania.
Zestaw buforów do oczyszczania przeciwciał	1 Zestaw		Gotowe bufory zalecane do oczyszczania przeciwciał przy użyciu Protein A HP MultiTrap™, Protein A HP SpinTrap™, HiTrap™ Protein A HP i HiTrap™ rProtein A FF.

Tabela 3.5 Warunki wiązania i elucji powszechnie stosowane z podłożami chromatograficznymi Protein A Sepharose® do oczyszczania IgG z różnych gatunków.

Gatunek	Podklasa	PH wiązania białka A	PH elucji białka A
Człowiek	IgG1  IgG2 IgG3 IgG4	6.0 do 7,0  6,0 do 7,0 8,0 do 9,0 7,0 do 8,0	3,5 do 4,5  3,5 do 4.5 ≤ 7,0 3,0 do 6,0
Krowy	IgG2	n.d.	2.0
Koza	IgG2	n.a.	5.8
Świnka morska	IgG1  IgG2	n.a.  n.a.	4.8  4.3
Mouse	IgG1  IgG2a IgG2b IgG3	8.0 do 9,0  7,0 do 8,0 Około 7,0 Około 7.0	4,5 do 6,0  3,5 do 5,5 3,0 do 4,0 3,5 do 5.5
Szczur	IgG1  IgG2a IgG2b IgG3	≥ 9.0  ≥ 9.0 ≥ 9.0 8.0 do 9.0	7.0 do 8.0  ≤ 8.0 ≤ 8.0  3.0 do 4.0 (przy użyciu 3 M izotiocyjanianu potasu)

Uwagi dotyczące stosowania

Siły wiązania są testowane z wolnym białkiem A i mogą być używane jako wytyczne do przewidywania zachowania wiązania z podłożem oczyszczającym białko A. Jednak po połączeniu z matrycą powinowactwa interakcja może ulec zmianie. Na przykład szczurze IgG₁ nie wiąże się z białkiem A, ale wiąże się z białkiem A Sepharose^®.

W przypadku niektórych przeciwciał, na przykład mysich IgG₁, do uzyskania skutecznego wiązania może być konieczne wysokie stężenie chlorku sodu w buforze wiążącym. Zalecane bufory wiążące to 1,5 M glicyna, 3 M chlorek sodu, pH 8,9 lub 0,02 M fosforan sodu, 3 M chlorek sodu, pH 7,0.

Większość przeciwciał i podklas wiąże białko A w pobliżu fizjologicznego pH i siły jonowej. Unikaj nadmiernego płukania, jeśli interakcja między interesującym białkiem a ligandem jest słaba, ponieważ może to zmniejszyć wydajność.

Używaj łagodnej metody elucji, gdy izolowane są labilne przeciwciała. Odwróć przepływ buforu płuczącego i eluuj za pomocą 0,1 M glicylo-tyrozyny w 2 M chlorku sodu, pH 7,0 w temperaturze pokojowej, stosując pulsacyjnie. (Uwaga: glicylo-tyrozyna silnie absorbuje przy długościach fal używanych do wykrywania białek). Specyficzna elucja jest tak łagodna, że jest mało prawdopodobne, aby oczyszczona IgG uległa denaturacji. Alternatywne bufory elucyjne obejmują: 1 M kwas octowy pH 3,0, 0,1 M glicyna-HCl pH 3,0 lub 3 M izotiocyjanian potasu. Uwaga: izotiocyjanian potasu może poważnie wpływać na strukturę i aktywność immunologiczną.

Odsolić i/lub przenieść oczyszczone frakcje IgG do odpowiedniego buforu za pomocą kolumny odsalającej.

Aby zwiększyć pojemność, połącz szeregowo kilka kolumn HiTrap (1 ml lub 5 ml). Alternatywnie można zapakować większą kolumnę z nProtein A Sepharose^® 4 Fast Flow lub rProtein A Sepharose^® 4 Fast Flow (patrz Pakowanie i przygotowanie kolumn). Podczas pracy z fermentacją na dużą skalę należy rozważyć użycie dowolnego nośnika chromatograficznego MabSelect. MabSelect został zaprojektowany tak, aby zachować wysoką zdolność wiązania przy wyższych prędkościach przepływu wymaganych do przetwarzania dużych objętości próbek tak szybko, jak to możliwe (patrz nośniki do chromatografii MabSelect i wstępnie zapakowane kolumny w dalszej części tego rozdziału).

Ponowne użycie nośnika do chromatografii Protein A Sepharose^® zależy od charakteru próbki i powinno być rozważane tylko w przypadku przetwarzania identycznych próbek w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.