Rozwiązywanie problemów z chromatografią jonowymienną

Rysunek 1. Idealna separacja IEX: białka docelowe dobrze rozdzielone przez elucję gradientową

Jeśli tylko niektóre piki są interesujące w tym dobrze rozdzielonym rozdziale, korzystne może być przejście do elucji etapowej w celu zaoszczędzenia czasu i buforu. Pozostała część tej sekcji koncentruje się na praktycznych problemach, które mogą prowadzić do nieidealnej separacji IEX.

Rysunek 2. Próbka eluuje przed rozpoczęciem gradientu soli

Należy upewnić się, że bufory znajdują się w odpowiednich pojemnikach. Zmniejsz siłę jonową próbki przez odsolenie, strona 156 lub rozcieńczenie buforem startowym. W przypadku wymieniacza anionowego zwiększyć pH buforu, w przypadku wymieniacza kationowego zmniejszyć pH buforu. Jeśli białka nadal nie wiążą się przy żadnym pH, możliwe jest, że kolumna została zanieczyszczona detergentem.

Rysunek 3. Próbka nadal eluuje po rozpoczęciu gradientu

Po nałożeniu próbki ślad UV musi powrócić do linii bazowej przed rozpoczęciem elucji, w przeciwnym razie białka, które nie wiążą się z kolumną, zakłócają separację. Zwiększ objętość buforu startowego (etap wyrównania) przed rozpoczęciem elucji gradientowej.

Rysunek 4. Próbka eluuje się podczas płukania wysoką solą

Białka wiążą się zbyt silnie. Upewnij się, że bufory znajdują się w odpowiednich pojemnikach. Jeśli używasz wymieniacza anionowego, zmniejsz pH buforu, jeśli używasz wymieniacza kationowego, zwiększ pH buforu.

Białko(a) będące przedmiotem zainteresowania eluujące późno w gradiencie

Białka wiążą się zbyt silnie. Zwiększ siłę jonową gradientu. Zaleca się zmianę pH, jeśli do elucji wymagane jest bardzo wysokie stężenie soli. W przypadku wymieniacza anionowego należy zmniejszyć pH buforu, a w przypadku wymieniacza kationowego zwiększyć pH buforu. Patrz także Tabela 6.

Białka będące przedmiotem zainteresowania eluują zbyt wcześnie w gradiencie:

Białka nie wiążą się silnie. Sprawdź siłę jonową gradientu. Zmień pH, w przypadku wymieniacza anionowego zwiększ pH buforu, a w przypadku wymieniacza kationowego zmniejsz pH buforu. Patrz także Tabela 6.

Białka będące przedmiotem zainteresowania nie są wystarczająco rozdzielone

Odnieś się do treści tego rozdziału, aby przejrzeć kluczowe parametry w celu poprawy rozdzielczości. Patrz także Tabela 6.

Tabela 6.Rozwiązywanie problemów.

Sytuacja	Przyczyna	Reagowanie
Zmniejszony przepływ lub brak przepływu przez kolumnę.	Wylot zamknięty lub pompy nie działają.	Otwórz wylot. Sprawdź pompy pod kątem oznak wycieku (jeśli używasz pompy perystaltycznej, sprawdź również rurki).
	Zablokowany filtr, końcówka, adapter lub rurka.	Wyjmij i wyczyść lub wymień, jeśli to możliwe. Zawsze filtruj próbki i bufor przed użyciem.
	Wytrąciły się lipoproteiny lub agregaty białek.	Usuń lipoproteiny i agregaty podczas przygotowywania próbki (Appendix 1). Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia, Appendix 10.
	Wytrącanie się białka w kolumnie.	Modyfikacja buforu, pH i/lub warunków soli podczas przebiegu w celu utrzymania stabilności. Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia,  Załącznik 10.
	Wytrącanie się białka w kolumnie spowodowane usunięciem czynników stabilizujących podczas separacji.	Zmień eluent, aby utrzymać stabilność.
	W kolumnie wystąpił wzrost drobnoustrojów.	Przechowywać w obecności 20% etanolu, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów, gdy nie są używane. Zawsze filtruj bufory. Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia,  Załącznik 10.
Pik zainteresowania jest słabo rozdzielony od innych głównych pików.	Próbka została zastosowana nieprawidłowo.	Sprawdź powierzchnię złoża i górny filtr pod kątem możliwych zanieczyszczeń.
	Duże przestrzenie mieszania na górze lub za kolumną.	W razie potrzeby dostosuj górny adapter do powierzchni pożywki. Zmniejsz wszystkie objętości po kolumnie.
	Nieprawidłowe pH buforu i/lub siła jonowa.	Sprawdź pH i siłę jonową, aby upewnić się, że kolumna została ponownie skalibrowana po poprzednim przebiegu. Sprawdź wymagane warunki. Przygotuj nowe roztwory.
	Nieoptymalne warunki elucji, np. nieprawidłowe pH, zbyt stromy gradient, zbyt wysokie natężenie przepływu.	Zmień warunki elucji: zmień pH, użyj płytszego gradientu, zmniejsz szybkość przepływu (wymienione w kolejności priorytetów).
	Próbka jest zbyt lepka.	Rozcieńczyć buforem. Utrzymuj stężenie białka poniżej 50 mg/ml.
	Kolumna jest źle wypełniona.	Sprawdź wydajność kolumny (Załącznik 3). W razie potrzeby przepakować. Użyj wstępnie zapakowanych kolumn.
	Kolumna przeciążona.	Zmniejsz obciążenie próbki.
	Wytrąciły się lipoproteiny lub agregaty białek.	Usuń lipoproteiny i agregaty podczas przygotowywania próbki (Załącznik 1).
	Precypitacja białek w kolumnie.	Zmień warunki buforu, pH i/lub soli podczas przebiegu, aby utrzymać stabilność.
	W kolumnie wystąpił wzrost drobnoustrojów.	Przechowywać w obecności 20% etanolu, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów. Zawsze filtruj bufory. Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia,  Załącznik 10.
Białka nie wiążą się lub nie eluują zgodnie z oczekiwaniami.	Białka lub lipidy wytrąciły się na kolumnie lub filtrze kolumny.	Wyczyść kolumnę i wymień lub wyczyść filtr. Sprawdź pH i stabilność soli w próbce.
	Próbka nie została prawidłowo przefiltrowana.	Wyczyść kolumnę, przefiltruj próbkę i powtórz.
	Próbka uległa zmianie podczas przechowywania.	Przygotuj świeże próbki.
	Białko może być niestabilne lub nieaktywne w buforze elucyjnym.	Określ pH i stabilność soli białka.
	Niekompletna równowaga kolumny.	Powtórz lub przedłuż etap wyrównywania, aż przewodność i pH będą stałe.
	Nieprawidłowe pH buforu i/lub siła jonowa.	Sprawdź wymagane warunki. Przygotuj nowe roztwory.
	Białka tworzą agregaty i silnie wiążą się z podłożem.	Użyj mocznika lub zwitterionów, betainy do 10%, tauryny do 4%.
	Próbka lub warunki buforu różnią się od poprzednich przebiegów	Sprawdź próbkę i warunki buforu.
	W kolumnie wystąpił wzrost drobnoustrojów.	Przechowywać w obecności 20% etanolu, aby zapobiec wzrostowi drobnoustrojów, gdy nie są używane. Zawsze filtruj bufory. Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia,  Załącznik 10.
Białko eluuje później niż oczekiwano lub wcale.	Nieprawidłowe pH buforu.	Sprawdź kalibrację pH-metru. Użyj pH buforu bliższego pI białka.
	Zbyt niska siła jonowa.	Zwiększenie stężenia soli w buforze elucyjnym.
	Interakcje jonowe między białkiem a matrycą.	Utrzymywanie siły jonowej buforów powyżej 0,05 M.
	Oddziaływania hydrofobowe między białkiem a matrycą.	Zmniejszenie stężenia soli w celu zminimalizowania oddziaływań hydrofobowych. Zwiększyć pH. Dodaj odpowiedni detergent lub rozpuszczalnik organiczny, np. 5% izopropanol.
Białko eluuje wcześniej niż oczekiwano (podczas fazy płukania).	Siła jonowa próbki lub buforu jest zbyt wysoka.	Zmniejsz siłę jonową próbki lub buforu.
	Nieprawidłowe warunki pH.	Zwiększ pH (wymieniacz anionowy). Zmniejsz pH (wymieniacz kationowy).
	Niekompletna kalibracja kolumny.	Powtórz lub przedłuż etap wyrównywania, aż przewodność i pH będą stałe
Wiodące lub bardzo zaokrąglone piki na chromatogramie.	Kanałowanie w kolumnie.	Ponownie zapakuj kolumnę, używając rzadszej zawiesiny pożywki. Sprawdź upakowanie kolumny (Załącznik 3).
	Kolumna przeciążona.	Zmniejsz obciążenie próbki i powtórz.
	Kolumna zanieczyszczona.	Oczyść stosując zalecane procedury.
Piki są ogonowe.	Nieprawidłowe warunki buforu startowego, próbka nie wiąże się z kolumną.	Dostosuj pH. Sprawdź stężenie soli w buforze startowym.
	Próbka zbyt lepka.	Rozcieńczyć w buforze aplikacyjnym.
	Zbyt luźne wypełnienie kolumny.	Sprawdź wydajność kolumny (Załącznik 3). Przepakuj, używając wyższego natężenia przepływu. Użyj wstępnie zapakowanych kolumn.
Piki mają krawędź wiodącą.	Upakowanie kolumny ściśnięte.	Sprawdź wydajność kolumny (Dodatek 3). Przepakuj, używając niższego natężenia przepływu. Użyj wstępnie zapakowanych kolumn.
Średnie/perełki pojawiają się w eluencie.	Upakowanie kolumny skompresowane.	Sprawdź wydajność kolumny (Dodatek 3). Przepakuj używając wolniejszego tempa przepływu. Użyj wstępnie zapakowanych kolumn.
	Końcówka wspornika łoża jest poluzowana lub złamana.	Wymień lub dokręć.
	Kolumna pracuje przy zbyt wysokim ciśnieniu.	Nie przekraczaj zalecanego ciśnienia roboczego dla medium lub kolumny.
	Podłoże zostało uszkodzone podczas pakowania kolumny.	Nie używaj mieszadeł magnetycznych podczas wyrównywania luźnej pożywki
Niski odzysk aktywności, ale normalny odzysk białka.	Białko może być niestabilne lub nieaktywne w buforze.	Określ pH i stabilność soli białka.
	Enzym oddzielony od kofaktora lub podobnego.	Sprawdź, łącząc podwielokrotności z frakcji i powtarzając test.
Wydajność białka niższa niż oczekiwana.	Białko mogło zostać zdegradowane przez proteazy.	Dodaj inhibitory proteaz do próbki i buforów, aby zapobiec trawieniu proteolitycznemu. Przeprowadź próbkę przez medium takie jak Benzamidine 4 Fast Flow (high sub), aby usunąć proteazy serynowe podobne do rypsyny.
	Adsorpcja na filtrze podczas przygotowywania próbki	Użyj innego typu filtra.
	Próbka wytrąca się.	Sprawdź pH i warunki soli, dostosuj, aby poprawić rozpuszczalność próbki.
	Białka hydrofobowe.	Dodaj środki denaturujące, środki zmniejszające polarność lub detergenty. Dodaj 10% glikolu etylenowego do buforu roboczego, aby zapobiec interakcjom hydrofobowym.
	Niespecyficzna adsorpcja.	Zmniejsz stężenie soli, aby zminimalizować interakcje hydrofobowe. Dodać odpowiedni detergent lub rozpuszczalnik organiczny, np. 5% izopropanol. Jeśli to konieczne, dodaj 10% glikolu etylenowego do buforu roboczego, aby zapobiec interakcjom hydrofobowym.
Piki zbyt małe.	Próbka słabo absorbuje przy wybranej długości fali.	Jeśli to właściwe, sprawdź zakres absorbancji na monitorze. Jeśli jest zadowalający, użyj innej długości fali, np. 214 nm zamiast 280 nm.
	Zastosowano różne warunki testu przed i po etapie chromatograficznym.	Użyj tych samych warunków dla wszystkich testów.
	Nadmierne poszerzenie pasma.	Sprawdź opakowanie kolumny. W razie potrzeby przepakuj.
Więcej próbki jest odzyskiwane niż oczekiwano.	Białko współwystępujące z innymi substancjami.	Zoptymalizuj warunki, aby poprawić rozdzielczość. Sprawdź warunki buforu używanego do testu przed i po przebiegu. Sprawdź wybór pożywki.
Odzyskano więcej aktywności niż zastosowano na kolumnie.	Zastosowano różne warunki testu przed i po etapie chromatografii.	Użyj tych samych warunków testu dla wszystkich testów.
	Usuwanie inhibitorów podczas separacji.
Podciśnienie wzrasta podczas przebiegu lub podczas kolejnych przebiegów.	Podłoże skompresowane.	Jeśli to możliwe, przepakuj kolumnę lub użyj nowej kolumny. Sprawdź przygotowanie próbki.
	Rozwój drobnoustrojów.	Przechowywać w obecności 20% etanolu, aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów. Zawsze filtruj bufory. Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia,  Dodatek 10.
	Turbid sample.	Improve sample preparation (Appendix 1). Popraw rozpuszczalność próbki: dodaj betainę (maks. 10% w/v w temperaturze 25°C), taurynę (maks. 4% w/v w temperaturze 25°C, poniżej pH 8,5) lub glicerol (1-2%). W przypadku próbek hydrofobowych należy dodać glikol etylenowy, mocznik, detergenty lub rozpuszczalniki organiczne.
	Reprecypitacja białka w filtrze kolumny i/lub w górnej części złoża.	Oczyścić przy użyciu zalecanych metod. Jeśli to możliwe, wymień lub wyczyść filtr albo użyj nowej kolumny. Uwzględnij wszelkie dodatki, które zostały użyte do początkowej solubilizacji próbki w buforze roboczym.
	Nieprawidłowe pH powoduje wytrącanie.	Kalibruj pH-metr, przygotuj nowe roztwory i spróbuj ponownie. Zmień pH.
	Wytrącanie lipoprotein przy zwiększonej sile jonowej.	Lipoproteiny można usunąć przed chromatografią przez dodanie 10% siarczanu dekstranu (końcowe 0,2%) i 1 M chlorku wapnia (końcowe 0,5 M).
Pęcherzyki powietrza w złożu. Pęknięcia w złożu.	Bufory nie zostały prawidłowo odgazowane.	Dokładnie odgazuj bufory.
	Kolumna zapakowana lub przechowywana w niskiej temperaturze, a następnie podgrzana.	Usuń małe pęcherzyki powietrza przepuszczając odgazowany bufor przez kolumnę. Zachowaj szczególną ostrożność, jeśli bufory są używane po przechowywaniu w lodówce lub chłodni. Nie wolno dopuścić do nagrzania kolumny przez promienie słoneczne lub system grzewczy. Przepakuj kolumnę, jeśli to możliwe (Załącznik 3).
Pęknięcia w złożu.	Duży wyciek powietrza w kolumnie.	Sprawdź wszystkie połączenia pod kątem wycieków. Jeśli to możliwe, przepakuj kolumnę (Załącznik 3).
Negatywne piki na czole rozpuszczalnika.	Efekt współczynnika załamania światła.	Wymień próbkę na bufor startowy.
Nieoczekiwane piki na chromatogramie.	Zanieczyszczenia buforu.	Oczyść bufor, przepuszczając go przez kolumnę wstępną. Używaj odczynników wysokiej jakości.
Piki pojawiają się na gradientach.	Niekompletna elucja poprzedniej próbki	Umyj kolumnę zgodnie z zalecanymi metodami ślepej próby.
Piki na chromatogramie.	Pęcherzyk powietrza uwięziony w celi przepływowej monitora UV.	Zawsze używaj odgazowanych buforów.
Podstawa UV wzrasta wraz z gradientem.	Tworzenie się miceli wraz ze zmianą stężenia soli.	Pracuj poniżej lub powyżej krytycznego stężenia miceli wszelkich używanych detergentów lub zmień gradient tak, aby wzrost absorpcji UV nie występował podczas elucji próbek.
	Zanieczyszczenia bufora.	Używaj odczynników wysokiej jakości.

*Polarne rozpuszczalniki organiczne, takie jak metanol, etanol, izopropanol i acetonitryl mogą być stosowane w stężeniach od 0-20%, ale należy pamiętać, że niektóre białka mogą nieodwracalnie utracić swoją aktywność biologiczną w obecności rozpuszczalników organicznych. Przed uruchomieniem kolumny należy sprawdzić rozpuszczalność próbki i buforu, pH buforu i stabilność chemiczną medium.
Należy pamiętać, że ciśnienie wsteczne może wzrosnąć podczas pracy z roztworami organicznymi.

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch