Nukleaza Benzonase^® Pytania i odpowiedzi

Na jakie kwasy nukleinowe działa Benzonase^® Nuclease? Czy mogę jej użyć do izolacji RNA?

Benzonase^® Nuclease jest endonukleazą, która atakuje i degraduje wszystkie formy DNA i RNA (jednoniciowe, dwuniciowe, liniowe i koliste).

Dla jakich celów chciałbym użyć Benzonase^® Nuclease?

Zastosowania obejmują: zmniejszenie lepkości w celu ułatwienia przetwarzania (np, oczyszczanie białek rekombinowanych, aplikacje wrażliwe na lepkość przy użyciu lizatów komórek ssaków itp.); zmniejszenie zlepiania się przechowywanych próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przed przetwarzaniem; przygotowanie ciał inkluzyjnych w celu umożliwienia skutecznej renaturacji białek; oraz usuwanie ujemnie naładowanych kwasów nukleinowych z próbek przed dwuwymiarowym SDS-PAGE.

W jaki sposób można inaktywować nukleazę Benzonase^®? Jak można ją usunąć?

Odwracalną inhibicję można osiągnąć stosując EDTA do chelatowania niezbędnych jonów metali. Nieodwracalną inaktywację można osiągnąć tylko w ekstremalnych warunkach (100 mM NaOH w 70 °C przez 30 minut). Benzonazę można oddzielić od produktu docelowego za pomocą chromatografii. Jednak ze względu na silną naturę tej endonukleazy, zalecamy, aby nie używać Benzonazy, jeśli wymagany jest produkt końcowy wolny od nukleazy.

Moja nukleaza Benzonase^® została pozostawiona na ławce. Czy nadal jest dobry?

Przeprowadziliśmy szeroko zakrojone testy stabilności Benzonase Nuclease i stwierdziliśmy, że jest on wyjątkowo stabilny. Nawet przy przedłużonej inkubacji w temperaturze 37 °C, Benzonase^® Nuclease utrzymuje > 90% aktywności przez kilka miesięcy.

Chcę użyć innego buforu. Jakie warunki są absolutnie wymagane dla pełnej aktywności nukleazy Benzonase^®? Co zmniejszy jej aktywność?

Nukleaza Benzonase® wymaga 1-2 mM Mg2+ do aktywności. Benzonaza jest hamowana (około 50% aktywności) przez stężenia kationów jednowartościowych >50%, stężenia fosforanów >20 mM i stężenia siarczanu amonu >25 mM.

Czy nukleaza Benzonase^® jest kompatybilna z koktajlami inhibitorów proteaz?

Tak. Należy jednak zachować ostrożność, ponieważ wiele koktajli inhibitorów proteaz zawiera EDTA. Stężenia większe niż 1 mM EDTA będą hamować aktywność benzonazy.

Moje białko jest nierozpuszczalne i muszę przeprowadzić oczyszczanie w warunkach denaturujących. Czy nukleaza Benzonase^® będzie nadal działać w moczniku?

Aktywność nukleazy Benzonase^® faktycznie wzrasta w obecności mocznika w stężeniach do 6 M. Przy 6 M mocznika aktywność enzymu najpierw wzrasta, a następnie maleje w miarę upływu czasu. Przy 7 M mocznika, nukleaza Benzonase denaturuje po 15 minutach, a aktywność jest tracona. Jednak przed inaktywacją następuje znaczna degradacja kwasów nukleinowych. Wyższe początkowe stężenia Benzonase Nuclease mogą częściowo kompensować skutki 7 M mocznika.

Dlaczego istnieje tak wiele odmian Benzonase^® Nuclease? Co oznacza HC? Jaki wpływ ma czystość 90% w porównaniu do 99%?

Aby spełnić jak najszerszy zakres wymagań dotyczących przetwarzania i kosztów, nukleaza Benzonase^® jest dostępna w dwóch różnych klasach czystości: I stopień czystości (99% czystości) i II stopień czystości (90% czystości). Obie klasy są dostępne w stężeniu 25 U/μL lub w wysokim stężeniu (HC), które jest zdefiniowane jako 250 U/μL.

Jaki jest efekt końcowy całkowitej degradacji kwasu nukleinowego przez nukleazę Benzonase^®?

Nukleaza Benzonase^® całkowicie trawi kwasy nukleinowe do oligonukleotydów zakończonych 5'-monofosforanem o długości 2-5 zasad.