Terminy i obliczenia dotyczące inhibitorów enzymów

Czytaj dalej, aby poznać przydatne terminy i obliczenia dotyczące inhibitorów enzymów, zrozumieć kinetykę Michaelisa-Menten, w tym jak określić K_m i V_max, oraz jak dokładnie porównać enzymy pod względem wydajności katalitycznej.

• Przydatne terminy w badaniach nad inhibitorami enzymów
• Kinetyka Michaelisa-Mentena: Znaczenie K_m i V_max
• .Jak określić K_m i V_max
• Obliczanie wydajności katalitycznej w celu porównania enzymów

Przydatne terminy w badaniach nad inhibitorami enzymów

Niektóre specyficzne terminy są przydatne do zrozumienia podczas badań nad inhibitorami enzymów.

K_m

K_m to stężenie substratu, przy którym obserwuje się połowę maksymalnej prędkości reakcji w danym zestawie warunków (Rysunek 1). Jest to odwrotna miara siły wiązania między substratem a enzymem, gdzie niższe K_m oznacza wyższe powinowactwo i niższe stężenie substratu jest wymagane do osiągnięcia maksymalnej szybkości reakcji. Wartości K_m zależą od pH, temperatury i innych warunków reakcji.

Rysunek 1. Zależność między stężeniem substratu a maksymalną prędkością reakcji.

V_max

V_max to maksymalna prędkość reakcji w danych warunkach (Rysunek 1). V_max jest osiągane, gdy wszystkie miejsca enzymatyczne są nasycone substratem. Dzieje się tak, gdy stężenie substratu [S] jest większe niż K_m, tak że [S]/([S]+K_m) zbliża się do 1.

EC₅₀

EC₅₀ określa skuteczność kliniczną leku i jest podawane jako stężenie leku wymagane do uzyskania 50% maksymalnego efektu (może to być efekt hamujący lub stymulujący). Odpowiedź hamująca znajduje się w połowie drogi między wartością wyjściową a maksymalną po ekspozycji na cząsteczkę hamującą przez wybrany okres czasu. Termin ten jest zwykle używany w odniesieniu do farmaceutyków.

IC₅₀

IC₅₀ to stężenie wymagane do wytworzenia 50% inhibicji (Rysunek 2). Wymagana ilość inhibitora zależy od różnych czynników, takich jak stężenie substratu, dostępność celu, przepuszczalność komórek, czas trwania inkubacji, rodzaj użytych komórek i inne. Coś, na co należy zwrócić uwagę, to fakt, że niższe IC₅₀ generalnie oznacza silniejszy inhibitor, co może również oznaczać wyższą toksyczność przy niższych dawkach.

Najlepiej jest przeszukać literaturę, aby określić początkowe stężenie.

• Jeśli znane są opublikowane wartości K_i lub IC₅₀, użyj 5 do 10 razy wyższych niż te wartości, aby maksymalnie zahamować aktywność enzymu.
• Jeśli wartości K_i lub IC₅₀ są nieznane, należy wypróbować szeroki zakres stężeń inhibitora i zastosować kinetykę Michaelisa-Menten (więcej na ten temat poniżej) w celu określenia wartości K_i.

Nie jest niczym niezwykłym obserwowanie braku inhibicji lub nawet odwrotnego efektu, gdy stosowane są wysokie stężenia inhibitorów.

Rysunek 2. Zależność między stężeniem inhibitora a IC₅₀.

K_i

K_i to stężenie inhibitora, przy którym obserwuje się 50% inhibicję (K_i = stała inhibicji enzymu). Cheng i Prusoff opracowali w 1973 r. równanie, które upraszcza obliczanie K_i, gdy znane jest IC₅₀.¹

K_i można obliczyć z IC₅₀ używając równania:

gdzie [S] to stężenie substratu, a K_m to stężenie substratu (przy braku inhibitora), przy którym prędkość reakcji jest w połowie maksymalna. K_i inhibitora dla hamowania określonego substratu (stałe K_m) jest stałe. Dla innego substratu, K_m jest inne, podobnie jak K_i.

Kluczowe punkty:

• IC₅₀ jest funkcjonalną siłą inhibitora i nie jest wskaźnikiem jego powinowactwa.
• Wartość IC₅₀ dla związku może różnić się pomiędzy eksperymentami, w zależności od warunków eksperymentalnych.
• K_i odzwierciedla powinowactwo wiązania inhibitora. Jest to wartość bezwzględna.

ED₅₀

ED₅₀ to mediana skutecznej dawki (w przeciwieństwie do stężenia), przy której 50% osób wykazuje określony efekt ilościowy. Jest to miara rozsądnego oczekiwania efektu leku, ale niekoniecznie równa przepisanej dawce.

Kinetyka Michaelisa-Menten: Znaczenie K_m i V_max

Zrozumienie kinetyki Michaelisa-Menten jest kluczowe dla pracy z inhibitorami enzymów.

K_m Kinetyka

Stała Michaelisa-Menten, K_m, zdefiniowana jako stężenie substratu, przy którym obserwuje się połowę maksymalnej prędkości, różni się znacznie w zależności od enzymu. Różni się również w zależności od różnych substratów dla tego samego enzymu. Gdy stężenie substratu jest równe wartości K_m, połowa miejsc aktywnych enzymu jest zajęta przez cząsteczki substratu.

Kluczowe punkty dotyczące K_m:

• K_m jest stałą z jednostkami M
• K_m jest stałą wyprowadzoną ze stałych szybkości
• K_m jest, w prawdziwych warunkach Michaelisa-Menten, oszacowaniem stałej dysocjacji enzymu i substratu
• Małe K_m oznacza ścisłe wiązanie; duże K_m oznacza słabe wiązanie

.W modelu Michaelisa-Menten dla kinetyki enzymów zakłada się, że enzym najpierw reaguje z substratem, tworząc kompleks enzym-substrat (ES), który rozpada się, tworząc produkt (P) i wolny enzym (E). Stąd K_m można wyrazić w postaci trzech stałych szybkości (k₁, k_-1 i k₂).

K_m zależy również od temperatury, rodzaju substratu, pH środowiska reakcyjnego, siły jonowej i innych warunków reakcji. Dlatego ważne jest, aby scharakteryzować reakcje enzym-substrat w ściśle określonych warunkach. Każda zmiana wartości K_m wskazuje na obecność aktywatora lub inhibitora w środowisku reakcyjnym.

Przy bardzo niskich stężeniach substratu początkowa prędkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia substratu [S], a reakcja jest pierwszego rzędu w odniesieniu do substratu. Wraz ze wzrostem [S] początkowa szybkość reakcji spada i nie jest proporcjonalna do [S]. W tych warunkach reakcja ma charakter mieszany. Wraz z dalszym wzrostem [S], szybkość reakcji staje się niezależna od [S] i asymptotycznie zbliża się do stałej szybkości. W tym momencie reakcja jest rzędu zerowego, a enzym jest uważany za nasycony substratem. Przebieg czasowy powstawania kompleksu enzym-substrat i produktu można przedstawić tak, jak pokazano na Rysunku 3.

Rysunek 3. Czasowa zależność względnych stężeń składników reakcji enzymatycznej.

V_max Kinetyka

V_max, maksymalna szybkość reakcji, to szybkość, przy której całkowite stężenie enzymu jest obecne jako kompleks enzym-substrat. V_max reprezentuje maksymalną osiągalną szybkość reakcji w danych warunkach.

Kluczowe punkty dotyczące V_max:

• V_max jest stałą z jednostkami s^-1
• V_max jest teoretyczną maksymalną szybkością reakcji; w rzeczywistości nigdy nie jest ona osiągana
• Osiągnięcie V_max wymaga wszystkich cząsteczek enzymu.wymaga, aby wszystkie cząsteczki enzymu były związane z substratem
• V_max zbliża się asymptotycznie wraz ze wzrostem [S]

Jeśli znane jest początkowe stężenie enzymu, wówczas wartość k₂ można określić na podstawie V_max. Ponieważ k₂ jest stałą szybkości pierwszego rzędu, jest ona wyrażana na jednostkę czasu (na minutę lub sekundę). Znana jest również jako liczba rotacji lub stała katalityczna, k_cat. Liczba rotacji to liczba cząsteczek substratu, które można przekształcić w produkt w danym okresie czasu w warunkach, w których enzym jest całkowicie nasycony substratem.

Liczbę rotacji można łatwo oszacować, mierząc szybkość reakcji w warunkach nasycenia substratem (gdzie [S] jest większe niż K_m). Ogólnie rzecz biorąc, w warunkach fizjologicznych [S]/K_m jest mniejsze niż 1. Jeśli [S] jest większe niż K_m, wówczas prędkość początkową (V₀) reakcji można zapisać następująco:

W równaniu tym, k_cat/K_m jest miarą wydajności katalitycznej, z większą wartością odpowiadającą tworzeniu większej ilości produktu.

Inhibicja nieodwracalna i allosteryczna

Kinetyka Michaelisa-Mentena nie może być stosowana do inhibicji nieodwracalnej, ponieważ inhibitor tworzy silne wiązanie kowalencyjne z enzymem i nie może być usunięty. W związku z tym skuteczność nieodwracalnego inhibitora zależy od szybkości, z jaką zachodzi to wiązanie. Bardzo powszechnym przykładem nieodwracalnej inhibicji jest reakcja diizopropylofluorofosforanu (DFP) z acetylocholinoesterazą (AChE). DFP tworzy wiązanie kowalencyjne z grupą hydroksylową reszty serynowej w miejscu aktywnym AChE. Utworzony kompleks jest tak stabilny, że normalne funkcjonowanie nerwów zostaje przywrócone dopiero po zsyntetyzowaniu nowego enzymu.

Allosterycznie regulowane enzymy również nie pasują do równań Michaelisa-Menten. Tutaj zamiast hiperbolicznej krzywej reakcji uzyskuje się krzywą sigmoidalną. Enzymy te posiadają wiele miejsc wiązania, a ich aktywność jest regulowana przez wiązanie inhibitorów lub aktywatorów.

Jak określić K_m i Vmax<

K_m i V_max można określić eksperymentalnie poprzez inkubację enzymu z różnymi stężeniami substratu. Wyniki można wykreślić jako wykres prędkości lub szybkości reakcji (V) względem stężenia substratu [S]. Spowoduje to powstanie krzywej hiperbolicznej. Prędkość reakcji i K_m mają następującą zależność.

Nawet w rękach eksperta trudno jest dopasować najlepszą hiperbolę do wszystkich punktów doświadczalnych, aby dokładnie określić V_max. Naukowcy opracowali metody zmiany układu równania Michaelisa-Menten, aby umożliwić bardziej precyzyjne dopasowanie do punktów doświadczalnych i oszacowanie V_max i K_m. Jednak każda metoda ma pewne zalety i wady.

Wykres Lineweavera-Burka

Podwójny wykres wzajemny Lineweavera-Burka (Rysunek 4) jest jedną z najpopularniejszych metod, która przekształca równanie Michaelisa-Mentena w następujący sposób:

Kiedy wykreślimy 1/V względem 1/[S], otrzymamy linię prostą, gdzie:

• Intercept Y = 1/V_max
• Gradient/Slope = K_m/V_max
• Intercept X = -1/K_m

Rysunek 4. Typowy wykres Lineweavera-Burka.

Wykresy Lineweavera-Burka są najczęściej stosowanymi wykresami do linearyzacji danych i dają najdokładniejsze oszacowania K_m i V_max. Jednak metoda ta przypisuje nadmierną wagę punktom uzyskanym przy niższych stężeniach substratu, tj,

Wykres Eadie-Hofstee

Inną metodą graficznego przedstawienia kinetyki enzymatycznej jest wykres Eadie-Hofstee (Rys. 5), w którym szybkość reakcji jest wykreślana jako funkcja stosunku szybkości reakcji do stężenia substratu.

Wykres ten przekształca równanie Michaelisa-Menten w następujący sposób:

Gdy wykreślimy szybkość reakcji V względem V/[S], otrzymamy linię prostą, gdzie:

• Intercept Y = V_max
• Gradient/Slope = -K_m
• Intercept X = V_max/ K_m

Rysunek 5. Typowa fabuła Eadie-Hofstee.

W przeciwieństwie do wykresu Lineweavera-Burka, metoda ta nadaje równą wagę wszystkim punktom danych w dowolnym zakresie stężenia substratu. Wadą tej metody jest to, że osie X i Y nie reprezentują niezależnych zmiennych i obie są zależne od szybkości reakcji. Każdy błąd eksperymentalny lub błąd przyrządu wpłynie w większym stopniu na obie osie.

Obliczanie wydajności katalitycznej w celu porównania enzymów

Gdy porównujemy szybkość reakcji różnych enzymów działających na substrat lub tego samego enzymu działającego na różne substraty, obliczenie względnej wydajności katalitycznej może poinformować nas, który enzym najlepiej nadaje się do danego substratu (substratów) w danych warunkach.

Jeśli enzym działa w warunkach stanu ustalonego, wówczas parametrami kinetycznymi tego enzymu do rozważenia są k_cat (stała katalityczna konwersji substratu do produktu) i K_m (stała Michaelisa-Menten). Tutaj k_cat jest liczbą obrotową, która wskazuje, ile substratu jest przekształcane w produkt w określonym czasie. Stosunek k_cat/K_m jest równy wydajności katalitycznej, która jest następnie wykorzystywana do porównywania enzymów. Ta miara wydajności pomaga określić, czy szybkość jest ograniczona przez tworzenie produktu lub ilość substratu w mieszaninie reakcyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, górna granica k_cat/K_m jest określana przez szybkość dyfuzji substratu do miejsca aktywnego enzymu.

W pewnych warunkach enzym może działać na dwa nieco powiązane substraty. W tym przypadku należy wziąć pod uwagę względne szybkości reakcji z każdym substratem, ponieważ każdy substrat ma swoją własną wartość K_m. Jeśli jednak K_m jest jedynym wyznacznikiem specyficzności enzymu, to wraz ze wzrostem stosunku [S]/K_m powyżej 1, k_cat staje się najlepszym parametrem do określenia, który substrat jest lepszy. W przypadku dwóch substratów (x i y), na które jednocześnie działa ten sam enzym, można utworzyć następujące równanie dla względnych prędkości reakcji.

Tutaj V_x i V_y są prędkościami reakcji enzymu z substratami x i y. Stężenia substratów obu substratów to [S_x] i [S_y].

Znalezienie odpowiednich równań do swoich badań jest niezbędne do osiągnięcia sukcesu eksperymentalnego. Rozpocznij swój kolejny eksperyment już dziś, przeszukując nasze narzędzie wyszukiwania bioaktywnych małych cząsteczek, aby znaleźć wysokiej jakości sondy do swoich badań.

Referencje

1. Yung-Chi C, Prusoff WH. 1973. Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochemical Pharmacology. 22(23):3099-3108. https://doi.org/10.1016/0006-2952(73)90196-2