Kriokonserwowane PBMC zachowują fenotyp i funkcję

• Charakterystyka zamrożonych PBMC
• PBMC i aktywacja limfocytów T
  • Ekspresja CD25
  • Ekspresja CD69
  • Frozen PBMC Function Summary
• Materiały i metody
• Mrożone PBMC i produkty z komórek odpornościowych od BioIVT

Zamrożone (kriokonserwowane) jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) oferują wiele korzyści w porównaniu ze świeżymi PBMC, umożliwiając badaczom planowanie eksperymentów z wyprzedzeniem dzięki gotowym do użycia komórkom, które można przechowywać w zamrażarce do czasu ich użycia. Jedną z obaw związanych z zamrożonymi komórkami jest potencjalna utrata żywotności, fenotypu lub funkcji wynikająca z kriokonserwacji. Przedstawiamy charakterystykę zamrożonych PBMC z BioIVT, a także bezpośrednie porównanie odpowiedzi aktywacji komórek T poprzez pomiar poziomów ekspresji dobrze znanych markerów aktywacji komórek T (CD25 i CD69). Dane sugerują, że zamrożone PBMC zachowały żywotność i fenotyp podczas kriokonserwacji. Mimo zahamowania wzrostu, limfocyty T wykazywały odpowiednią odpowiedź aktywacyjną po stymulacji przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Funkcjonalne, żywotne PBMC poddane kriokonserwacji stanowią wygodną alternatywę dla świeżych PBMC w testach komórkowych i badaniach immunologicznych.

Charakterystyka zamrożonych PBMC

Zamrożone PBMC zostały najpierw ocenione pod kątem żywotności przy użyciu barwienia jodkiem propidyny i scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych przeciwko następującym markerom białkowym:

• CD14 (marker monocytów)
• CD56 (marker komórek NK)
• CD4 (podzbiór limfocytów T pomocniczych)
• CD8 (podzbiór limfocytów T)
• CD19 (limfocyty B)

Do wszystkich eksperymentów użyto kriokonserwowanych PBMC od trzech indywidualnych zdrowych dawców. Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 1. Wyniki dotyczące żywotności i składu podsumowano w Tabeli 1. Średnia żywotność komórek została określona na 91,8% (Rysunek 1.A.). Skład fenotypowy każdej populacji komórek, wyrażony jako procent populacji komórek bramkowanych (patrz Rysunek 1.B.), był zgodny z oczekiwanymi wartościami. Wyniki sugerują, że zamrożone PBMC zachowały żywotność i fenotyp podczas kriokonserwacji i rozmrażania.

Rysunek 1. A) Żywotność zamrożonych PBMC określona za pomocą barwienia jodkiem propidyny i cytometrii przepływowej. Obliczona żywotność komórek (uśredniona z trzech próbek) wyniosła 91,8%. B) Analiza fenotypowa zamrożonych PBMC. Komórki CD45+ analizowano pod kątem ekspresji CD14, CD19 i CD8/CD4 w celu określenia składu odpowiednio monocytów, komórek B i komórek T. W przypadku komórek NK zastosowano barwienie CD56. Tabelaryczne wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Żywotność i skład zamrożonych PBMC. Wszystkie populacje komórek zostały wybrane przez bramkowanie limfocytów i monocytów według wielkości i ekspresji CD45+, jak pokazano na Rysunku 1.B. Komórki T były dalej selekcjonowane przy użyciu połączonej bramki CD4+ i/lub CD8+. Wykorzystano zamrożone PBMC od trzech indywidualnych zdrowych dawców. Wyniki wskazują średnią wartość i odchylenie standardowe określone za pomocą cytometrii przepływowej.

	Wynik uśredniony
Zawodność	91.8% ± 2.2%
Skład populacji
Monocyty	32.0% ± 8,8%
Komórki NK	4.4% ± 2,0%
Komórki B	10,1% ± 1.6%
Komórki T (podzbiór CD4)	32.9% ± 4.1%
T Cells (CD8 Subset)	18.0% ± 4.0%

PBMC i aktywacja komórek T

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej składają się z limfocytów (komórek T, komórek B, komórek NK) i monocytów. Komórki te dają selektywne odpowiedzi układowi odpornościowemu i są kluczowymi graczami w odporności. Komórki T są aktywowane przez sygnały zewnątrzkomórkowe, w których pośredniczą głównie kompleksy receptorów komórek T (TCR). Wykazano, że niektórzy agoniści, tacy jak przeciwciała przeciwko CD3 i CD28, mogą wyzwalać sygnalizację TCR obserwowaną poprzez zmiany w ekspresji markerów powierzchniowych komórek, podobne do rzeczywistej aktywacji TCR poprzez stymulację antygenową. Aktywacja komórek T skutkuje zwiększoną ekspresją CD25 i przejściowo zwiększoną ekspresją CD69 (Rysunek 2). Markery powierzchniowe komórek CD25 i CD69 mogą być zatem stosowane jako mierniki aktywacji i funkcji komórek T.

Rysunek 2. Aktywowane limfocyty T wykazują zwiększoną ekspresję CD25 i przejściowo zwiększoną ekspresję CD69.

Aby ustalić, czy te zamrożone PBMC zachowały swoją funkcję, użyliśmy cytometrii przepływowej do pomiaru zmian CD25 i CD69 po stymulacji przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu zarówno świeżych, jak i zamrożonych PBMC.

Ekspresja CD25

Próbki PBMC były przetwarzane w trzech oddzielnych eksperymentach. W każdym eksperymencie porównywano ekspresję markerów powierzchniowych komórek przy użyciu dwóch próbek świeżych komórek od różnych dawców i dwóch próbek zamrożonych komórek od różnych dawców. Komórki aktywowano przy użyciu pożywki RPMI(+) zawierającej przeciwciała anty-CD3 (3 µg/ml) i anty-CD28 (1 µg/ml). Pożywka RPMI(+) bez przeciwciał aktywujących została użyta jako kontrola podstawowa. Komórki barwiono przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała anty-CD25 we wskazanych punktach czasowych po aktywacji i analizowano tego samego dnia za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3). Do analizy komórki były bramkowane według wielkości populacji limfocytów przy użyciu obszaru rozproszenia do przodu i obszaru rozproszenia bocznego. Komórki zostały następnie wybrane przez bramkowanie limfocytów przy użyciu ekspresji CD45+ i bramkowanie komórek T przy użyciu połączonej bramki CD4+ i/lub CD8+. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno świeże, jak i mrożone PBMC wykazywały wzrost ekspresji CD25 komórek T po aktywacji przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Świeże komórki wykazywały większy początkowy wzrost ekspresji CD25 w porównaniu do zamrożonych komórek po aktywacji, chociaż silną odpowiedź nadal obserwowano w przypadku zamrożonych komórek w dniach 1 i 3. Dłuższe inkubacje spowodowały większy wzrost ekspresji CD25 zarówno dla świeżych, jak i mrożonych komórek.

Rysunek 3. Ekspresja CD25 po 24 godzinach (A) lub 72 godzinach (B) po aktywacji, z próbkami kontrolnymi dopasowanymi do dawcy bez aktywacji dla każdego punktu czasowego. A-B) Reprezentatywne histogramy, z pokazanymi komórkami bramkowanymi na CD45+ WBC i CD4+ lub CD8+ dla limfocytów T. C) Zmiana procentu populacji komórek wyrażających CD25, obliczona jako różnica między próbkami aktywacji dopasowanymi do dawcy i próbkami bez aktywacji (świeże PBMC, n = 2; zamrożone PBMC, n = 4). D) Tabela przedstawiająca wartości przedstawione w C.

Ekspresja CD69

Eksperymenty i strategię bramkowania przeprowadzono tak, jak opisano dla CD25, stosując fluorescencyjnie znakowane przeciwciało anty-CD69 zamiast fluorescencyjnego przeciwciała anty-CD25. Wyniki przedstawiono na Rysunku 4. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno świeże, jak i mrożone PBMC wykazywały wzrost ekspresji CD69 komórek T po aktywacji przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Świeże komórki ponownie wykazywały większy początkowy wzrost ekspresji CD69 w porównaniu do zamrożonych komórek po aktywacji, chociaż wykrywalna odpowiedź była nadal obserwowana w przypadku zamrożonych PBMC. W przypadku CD69 znacznie większą odpowiedź zaobserwowano jeden dzień po aktywacji w porównaniu do trzech dni po aktywacji zarówno dla świeżych, jak i zamrożonych komórek. Jest to zgodne z oczekiwaną przejściową odpowiedzią markera powierzchni komórki CD69.

Rysunek 4. Ekspresja CD69 po 24 godzinach (A) lub 72 godzinach (B) po aktywacji, z próbkami kontrolnymi dopasowanymi do dawcy bez aktywacji dla każdego punktu czasowego. A-B) Reprezentatywne histogramy, z pokazanymi komórkami bramkowanymi na CD45+ WBC i CD4+ lub CD8+ dla komórek T. C) Zmiana procentu populacji komórek wyrażających CD69, obliczona jako różnica między próbkami aktywowanymi i nieaktywowanymi (świeże PBMC, n = 2; zamrożone PBMC, n = 4). D) Tabela przedstawiająca wartości przedstawione w C.

Podsumowanie funkcji mrożonych PBMC

Wyniki funkcjonalne podsumowano na Rysunku 5. Wzorce zmian w ekspresji markerów CD25 i CD69 odpowiadały oczekiwanym odpowiedziom zarówno dla świeżych, jak i mrożonych próbek PBMC. Mrożone PBMC wykazywały słabszą początkową aktywację w porównaniu do świeżych PBMC, mierzoną zmianami w ekspresji markerów CD25 i CD69. Pomimo tej różnicy, wykrywalne odpowiedzi zaobserwowano w przypadku zamrożonych komórek zarówno 24 godziny, jak i 72 godziny po aktywacji. Dane te sugerują, że zamrożone PBMC zachowują żywotność, fenotyp i funkcję po kriokonserwacji, oferując wygodną, gotową do użycia alternatywę dla świeżych komórek do większości zastosowań.

Rysunek 5. Podsumowanie danych porównujących aktywację świeżych i mrożonych PBMC mierzoną zmianami ekspresji markerów CD25 i CD69. Chociaż słabszą odpowiedź zaobserwowano w przypadku zamrożonych komórek, dane sugerują, że te kriokonserwowane PBMC zachowują swoją funkcję.

Materiały i metody

.

Materiały

Nr produktu	Opis
< href="sigma/humanbmc000644".	Opis
HUMANPBMC-0001993	Frozen Human Normal PBMC   fiolka 10 milionów komórek, Czystość: ≥ 85% czystości
	Świeże PBMC (AllCells®)
SAB4700041	.Przeciwciało anty-CD3, o niskiej zawartości endotoksyny, mysie monoklonalne  klon OKT3, oczyszczona immunoglobulina, buforowany roztwór wodny
217669	Anti-CD28 Mouse mAb (ANC28.1/5D10)  płyn, >95% (immunoglobulina, SDS-PAGE), klon ANC28.1/5D10
SAB47000363	Monoklonalne przeciwciało Anti-CD25-FITC produkowane u myszy  klon MEM-181, oczyszczona immunoglobulina, buforowany roztwór wodny
BD Biosciences 555530	Anti-CD69-FITC
FCMAB181F	Milli-Mark® Anti-CD14 -FITC Antibody, clone TUK4   clone TUK4, Milli-Mark®, from mouse
SAB4700450	Przeciwciało monoklonalne anty-CD56-APC produkowane u myszy   klon MEM-188, oczyszczona immunoglobulina, buforowany roztwór wodny
MABF416	Przeciwciało anty-CD4 (ludzkie), APC, klon OKT4  klon OKT4, od myszy
MABF167D	Anti-CD8a (human), PE, klon RPA-T8 Antibody  klon RPA-T8, od myszy, PE
FCMAB184F	Milli-Mark® Anti-CD19 -FITC Antibody, clone HD37   clone HD37, Milli-Mark®, from mouse
537060	Roztwór jodku propidium - CAS 25535-16-4 - Calbiochem    Wygodna forma jodku propidium przydatna w badaniach cytometrii przepływowej.
	Podłoże RPMI(+): RPMI zawierająca 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutaminy
	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)
	Bufor FACS: 95% PBS i 5% RPMI(+)

Rozmrażanie i obróbka komórek

1. Odmrażać zamrożone fiolki PBMC w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 2-5 minut.
2. Dodać pożywkę RPMI(+) zarówno do zamrożonych, jak i świeżych PBMC.
3. Odwirowywać komórki z prędkością 300 x g przez 5 minut.
4. Usuń supernatant.
5. Zawieś ponownie komórki w pożywce RPMI(+).
6. Zlicz komórki na hemocytometrze i umieść 100 000 żywych komórek w objętości 200 µl na studzienkę na 96-dołkowej płytce. Należy pamiętać, że próbki zostaną ponownie zawieszone w pożywce RPMI(+) zawierającej anty-CD3 (końcowe stężenie 3 µg/ml) i anty-CD28 (końcowe stężenie 1 µg/ml) w przypadku stymulacji i odpowiedzi aktywacyjnej lub tylko w pożywce RPMI(+) w przypadku próbek nieaktywowanych.

Barwienie komórek i bramkowanie na cytometrze przepływowym

1. Do wszystkich etapów płukania użyj buforu FACS.
2. Zacznij od próbek na 96-dołkowej płytce, jak opisano w sekcji "Rozmrażanie i obróbka komórek". Przenieś całą objętość każdej studzienki (~200 µl) do poszczególnych probówek mikrowirówkowych.
3. Dodaj 1 ml buforu FACS do każdej probówki mikrowirówkowej.
4. Odwiruj probówki mikrowirówkowe w wirówce z prędkością 300 x g przez 5 minut. Upewnij się, że komórki tworzą osad. Jeśli nie ma widocznego osadu, powtórz wirowanie komórek.
5. Usuń supernatant do linii 50 µl na probówce do mikrowirówki. Ponownie zawiesić komórki za pomocą lekkiego pipetowania.
6. Dodać znakowane fluorem przeciwciało przeciwko pożądanemu markerowi powierzchniowemu komórek i inkubować w ciemności przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
7. Powtórzyć kroki 3-5.
8. Zawiesić ponownie komórki w 250 µl buforu FACS i wymieszać przez delikatne pipetowanie. W razie potrzeby wybarw komórki pod kątem żywotności.
9. Przenieś pełną objętość (~300 µl) z każdej probówki do mikrowirówki na 96-dołkową płytkę z dnem U do analizy przy użyciu cytometru przepływowego Guava^® easyCyte™ 8HT.

.

Mrożone PBMC i produkty z komórek odpornościowych od BioIVT

Z dumą oferujemy mrożone PBMC od BioIVT.

.

 

Zobacz naszą pełną listę normalnych PBMC, PBMC w stanie chorobowym i podgrup komórek odpornościowych od BioIVT.