Pakowanie kolumn i przygotowanie do chromatografii wykluczania wielkością

Dobrze zapakowana kolumna jest niezbędna do frakcjonowania o wysokiej rozdzielczości na dowolnym podłożu SEC. Wstępnie zapakowane kolumny firmy Cytiva zapewnią powtarzalne wyniki i najwyższą wydajność. Jeśli wymagana objętość kolumny lub medium nie są dostępne w postaci wstępnie zapakowanej kolumny, skontaktuj się z lokalnym przedstawicielem handlowym Cytiva, aby zapytać o nasze usługi pakowania kolumn.

Pakowanie kolumny jest bardzo ważnym etapem każdego eksperymentu SEC. Źle zapakowana kolumna spowoduje nierównomierny przepływ, poszerzenie piku i utratę rozdzielczości. Może to również wpływać na osiągalne szybkości przepływu. Jeśli zdecydujesz się na samodzielne pakowanie kolumny SEC, wytyczne zawarte w tym dodatku będą miały zastosowanie w każdej skali działania.

Dostępny jest film instruktażowy na płycie CD, który demonstruje, jak wyprodukować dobrze zapakowaną kolumnę (Informacje o zamawianiu pakowania kolumn do filmu). Skupia się on w szczególności na znaczeniu upakowania kolumny dla filtracji żelowej. SEC jest łatwa do przeprowadzenia po uzyskaniu dobrze upakowanej kolumny. Pod warunkiem, że kolumna jest używana i konserwowana ostrożnie, można oczekiwać, że zapewni powtarzalne wyniki o wysokiej rozdzielczości przez długi czas.

Upewnij się, że jest wystarczająca ilość buforu do długich, nienadzorowanych przebiegów lub że pompa jest zaprogramowana tak, aby zatrzymać przepływ po odpowiednim czasie. Kolumny SEC, które wyschną, muszą zostać ponownie zapakowane.

Kolumny do pakowania nośników SEC

Puste kolumny Cytiva są w pełni kompatybilne z wysokimi prędkościami przepływu osiąganymi dzięki nowoczesnym nośnikom i dostępny jest szeroki zakres wymiarów kolumn. Informacje na temat zamawiania pustych kolumn i głównych akcesoriów można znaleźć na końcu niniejszego podręcznika.

Tabela A1.1 Maksymalna wysokość złoża (cm) i objętość złoża (ml) przy użyciu jednego lub dwóch adapterów w kolumnach XK

Z jednym adapterem			Z dwoma adapterami
Kolumna	Objętość (mL)	Wysokość łóżka (cm)	Objętość (mL)	Wysokość łóżka (cm)
XK 16/20	5 do 31	2.5 do 15.5	0 do 31	0 do 15.5
XK 16/40	45 do 70	22.5 do 35	16 do 70	8 do 35
XK 16/70	105 do 130	52.5 do 65	76 do 130	38 do 65
XK 16/100	165 do 190	82.5 do 95	136 do 190	68 do 95
XK 26/20	5 do 66	1 do 12.5	0 do 66	0 do 12.5
XK 26/40	122 do 186	23 do 35	45 do 186	8.5 do 35
XK 26/70	281 do 344	53 do 65	204 do 344	38.5 do 65
XK 26/100	440 do 504	83 do 95	365 do 504	68.5 do 95
XK 50/20	0 do 274	0 do 14	0 do 274	0 do 14
XK 50/30	265 do 559	14 do 28	0 do 559	0 do 28
XK 50/60	794 do 1088	40 do 56	500 do 1088	26 do 56
XK 50/100	1588 do 1862	81 do 95	1274 do 1862	65 do 95

Adaptery to regulowane elementy końcowe kolumny, które pomagają wyeliminować wszelkie zakłócenia powierzchni wypełnionego medium podczas nakładania próbki i zapobiegają przedostawaniu się nierozpuszczalnych cząstek i blokowaniu kolumny.

Puste kolumny Tricorn i XK są dostarczane z jednym adapterem, ale zamiast elementu końcowego kolumny można użyć drugiego adaptera, jeśli wymagana jest mniejsza wysokość złoża. Kolumny HiScale™ są wyposażone w podwójne adaptery. Dla wszystkich pustych kolumn dostępny jest szereg akcesoriów.

Tabela A1.2 Objętość i wysokość łóżka dla kolumn Tricorn

Z jednym adapterem				Z dwoma adapterami
Kolumna trójramienna	Kolumna i.d. (mm)	Objętość (mL)	Wysokość łóżka (mm)	Objętość (mL)	Wysokość łóżka (mm)
Tricorn 10/20	10	0.00 do 2.29	0 do 29	0.00 do 2.07	0 do 26
Tricorn 10/100	10	6.21 do 8.57	79 do 109	3.64 do 8.36	46 do 106
Tricorn 10/150	10	10.14 do 12.50	129 do 159	7.57 do 12.28	96 do 156
Tricorn 10/200	10	14.07 do 16.42	179 do 209	11.50 do 16.21	146 do 206
Tricorn 10/300	10	21.92 do 24.28	279 do 309	19.35 do 24.06	246 do 306
Tricorn 10/600	10	45.48 do 47.84	579 do 609	42.91 do 47.63	546 do 606

Tabela A1.3 Wysokości i objętości łoża dla kolumn HiScale

Kolumna	Max. wysokość łoża kolumny (cm), maks. objętość kolumny (ml) z jednym adapterem
HiScale 16/20	20 cm, 40 mL
HiScale 26/20	20 cm, 106 mL
HiScale 16/40	40 cm, 80 mL
HiScale 26/40	20 cm, 212 mL
HiScale 50/20	20 cm, 393 mL
HiScale 50/40	20 cm, 785 mL

Dłuższe kolumny (50 cm i więcej) mogą być trudne do zapakowania w normalnych warunkach laboratoryjnych. Alternatywą jest skorzystanie z naszych usług pakowania kolumn lub połączenie szeregowe dwóch lub więcej krótszych kolumn (o wysokości złoża 20 lub 30 cm) w celu uzyskania wymaganej wysokości złoża.

Sprawdzanie wydajności kolumny

Wydajność kolumny należy sprawdzać w regularnych odstępach czasu, określając teoretyczną liczbę płytek i symetrię piku. Należy pamiętać, że wynik wydajności kolumny zależy od zastosowanego systemu, w tym kapilar i objętości martwych. Oznacza to, że wydajność kolumny podana w specyfikacji kolumny (testowanej w innym systemie) nie będzie taka sama jak początkowy wynik wydajności kolumny.

Typowe wartości wydajności kolumny:
Superdex prep grade: Wydajność N/m > 10 000, Symetria piku A_s = 0,70 do 1,30 Sephacryl HR: Wydajność N/m < 9000, symetria piku A_s = 0,80 do 1,50

1. 1. Wyrównać wypełnioną kolumnę w wodzie destylowanej przy zalecanym natężeniu przepływu podanym w instrukcji.
2. Wstrzyknąć aceton (20 mg/ml w wodzie) w objętości odpowiadającej 0,2% całkowitej objętości wypełnionej kolumny.2% całkowitej objętości wypełnionej kolumny.
3. Monitoruj absorbancję UV 280 nm od momentu wstrzyknięcia do momentu elucji piku acetonu i powrotu sygnału do wartości wyjściowej.
4. Oblicz wydajność kolumny, czyli liczbę teoretycznych płytek na metr (N/m):

N/m = 5.54 (V_e / W_1/2)²/L
gdzie
V_e = objętość elucji (retencji) piku
W_1/2 = szerokość piku w połowie wysokości piku
L = wysokość złoża (m)
V_e i W_1/2 są w tych samych jednostkach
Oblicz współczynnik asymetrii (A_s):
A_s = b/a
gdzie
a = szerokość pierwszej połowy piku przy 10% wysokości piku
b = szerokość drugiej połowy piku przy 10% wysokości piku

Rysunek A1.1 Określenie wydajności kolumny na podstawie liczby płytek teoretycznych i symetrii piku.

Pakowanie kolumn do frakcjonowania o wysokiej rozdzielczości przy użyciu Superdex prep grade i Sephacryl High Resolution

Superdex prep grade i Sephacryl High Resolution powinny być pakowane i równoważone przy wysokim natężeniu przepływu przy użyciu kolumny z serii XK. Kolumny XK są optymalnie zaprojektowane do SEC

z konstrukcją złoża, która zapewnia równomierny przepływ cieczy i martwą przestrzeń na wylocie kolumny mniejszą niż 0,1% objętości kolumny, aby zminimalizować rozcieńczenie i zapobiec ponownemu mieszaniu się oddzielonych pików. Kolumny XK są produkowane z materiałów, które nie kolidują z labilnymi substancjami biologicznymi. Są łatwe do demontażu i ponownego montażu w celu dokładnego czyszczenia, co jest szczególnie ważne podczas pracy z próbkami biologicznymi.

Upewnij się, że kolumna i wszystkie elementy są czyste i w dobrym stanie. Szczególnie ważne jest, aby siatki, elementy mocujące siatki i szklana rurka nie były uszkodzone. Należy używać dobrze odgazowanych buforów i wyrównać wszystkie materiały do temperatury, w której będzie przeprowadzana separacja. Unikaj kolumn z dużymi objętościami martwymi, ponieważ wpłynie to na rozdzielczość.

Dla frakcjonowania o wysokiej rozdzielczości, użyj wysokości złoża od 30 do 60 cm. Zastosuj objętość próbki odpowiadającą od 1% do 2% objętości kolumny. Objętość próbki można zwiększyć do 4%, jeśli rozdzielczość w danym zastosowaniu jest wystarczająco dobra.

Osadzone medium powinno mieć objętość 1.Tabela A1.1 do A1.3 dla przykładów.

1. Superdex prep grade i Sephacryl HR są dostarczane spęcznione w zawiesinie zawierającej 20% etanolu jako środek konserwujący. Zawiesić pożywkę przez delikatne wstrząsanie i wlać wystarczającą ilość do szklanego cylindra lub zlewki z podziałką.
   Unikać używania mieszadeł magnetycznych, szpatułek lub szklanych prętów, ponieważ mogą one uszkodzić matrycę.
2. Umyć pożywkę 5 do 10 objętościami wody destylowanej na szklanym filtrze i ponownie zawiesić w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 50% osadzonej pożywki. Pożywkę należy dokładnie przemyć, aby usunąć 20% roztwór do przechowywania etanolu. Pozostałości etanolu mogą zakłócać kolejne procedury.
   Aby uzyskać bardziej równomiernie rozproszoną zawiesinę Superdex prep grade, można dodać Tween™ 20 (250 ml na 500 ml przemytej zawiesiny) w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego.
3. Zwilż filtr dolny, wstrzykując wodę destylowaną przez rurkę wylotową. Zamknij wylot części końcowej. Zamontuj filtr i dolną część końcową na kolumnie.
4. Zamocuj szczelnie zbiornik uszczelniający do kolumny.
   W przypadku kolumn XK 16 i XK 26 użycie drugiej kolumny zamiast zbiornika uszczelniającego ułatwia uzyskanie dobrze wypełnionej kolumny. Druga kolumna jest używana z łącznikiem uszczelniającym XK 16 lub XK 26, w zależności od potrzeb.
5. Zamontuj kolumnę i zbiornik uszczelniający pionowo na statywie laboratoryjnym.
6. Napełnij kolumnę wodą destylowaną do wysokości 2 cm powyżej końcówki kolumny. Unikaj pęcherzyków powietrza.
7. Odgazuj zawieszone medium pod próżnią i ostrożnie przelej zawieszone medium po ściance kolumny za pomocą szklanego pręta. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wlej wszystko w jednej operacji i napełnij zbiornik do góry wodą destylowaną.
8. Podłącz wylot pompy do wlotu na zbiorniku uszczelniającym. Otwórz wylot kolumny i rozpocznij przepływ buforu, Tabela A1.4 dla zaleceń dotyczących przepływu.
   Aby osiągnąć zadowalającą wydajność kolumny, Superdex prep grade musi być pakowany w dwóch etapach: Etap 1 przez 2 h lub do osiągnięcia stałej wysokości złoża i Etap 2 przez 60 min. Tabela A1.4 przedstawia natężenia przepływu dla każdego etapu.
   Sephacryl HR może być zwykle pakowany zadowalająco przy użyciu tylko wyższego natężenia przepływu podanego w etapie 2 tabeli A1.4. Użyj dwuetapowego procesu, jeśli wydajność kolumny była niezadowalająca po pierwszej próbie.
9. Zatrzymaj pompę i wyjmij zbiornik wypełnienia. Ostrożnie napełnij kolumnę wodą destylowaną, aby utworzyć u góry menisk i włóż adapter. Dopasuj adapter do powierzchni wypełnionego złoża.
10. Kontynuuj wypełnianie kolumny z prędkością przepływu użytą w kroku 2 przez około 10 minut. Jeśli nie można uzyskać zalecanego natężenia przepływu, należy użyć maksymalnego natężenia przepływu, jakie może zapewnić pompa. Zaznacz położenie górnej części wypełnionej pożywki, zatrzymaj pompę, zamknij wylot kolumny, przesuń adapter w dół na powierzchnię pożywki, a następnie wsuń adapter na kolejne 3 mm do pożywki. Kolumna jest teraz gotowa do użycia. Tabela A1.4 dla maksymalnego zalecanego natężenia przepływu i ciśnienia roboczego dla mediów Sephacryl HR i Superdex prep grade.
    Nie przekraczać maksymalnych ciśnień podczas pakowania: 0,2 do 0,4 MPa, 2 do 4 barów odpowiednio dla Sephacryl S-300 HR i S-100 HR, 0,15 MPa, 1,5 bara dla Sephacryl S-400 HR i S-500 HR oraz 0,4 do 0,5 MPa, 4 do 5 barów dla Superdex prep grade (75 i 200). Zawsze należy sprawdzić szczegółowe instrukcje dotyczące przechowywania dołączone do produktu.

Tabela A1.4 Zalecane natężenia przepływu podczas pakowania kolumny

Wysokość łóżka (cm)		Krok 1 Sephacryl HR (ml/min)	Krok 2 Sephacryl HR (mL/min)	Krok 1 Superdex prep grade (mL/min)	Step 2 Superdex prep grade (mL/min)
XK 16/40	35	1 do 2	2 do 4	1 do 2	4 do 6
XK 16/70	65	1 do 2	2 do 4	1 do 2	4 do 6
XK 16/100	95	1 do 2	2 do 4	1 do 2	4 do 6
XK 26/40	35	2 do 4	4 do 8	2 do 4	10 do 14
XK 26/70	65	2 do 4	4 do 8	2 do 4	10 do 14
XK 26/100	95	2 do 4	4 do 8	2 do 4	10 do 14
XK 50/20	10 do 15	8 do 10	4 do 8	9 do 11	19 do 21
XK 50/30	20 do 25	8 do 10	4 do 8	9 do 11	19 do 21
XK 50/60	55	8 do 10	4 do 8	9 do 11	19 do 21
XK 50/100	95	8 do 10	4 do 8	9 do 11	19 do 21

Pakowanie kolumn do separacji grupowej z użyciem Sephadexu

Sephadex jest dostarczany w postaci suchego proszku i przed użyciem należy go spęcznieć w nadmiarze buforu. Po spęcznieniu należy dodać bufor, aby utworzyć gęstą zawiesinę, z której pęcherzyki powietrza są usuwane pod próżnią. Odpowiednie jest około 75% osiadłego medium. Drobne cząstki można zdekantować.

Przyspiesz proces pęcznienia za pomocą wrzącej łaźni wodnej (Tabela A1.5). Służy to również do odgazowania zawiesiny. Pozostawić zawiesinę do ostygnięcia przed użyciem.

Tabela A1.5 Objętość złoża i czas pęcznienia dla Sephadexu

Średnia	Przybliż. objętość złoża (ml/1 g medium)	Czas wymywania (h), 20 °C	Czas wymywania (h), 90 °C
Sephadex G-10 Medium	2 do 3	3	1
Sephadex G-25 (wszystkie gatunki)	4 do 6	3	1
Sephadex G-50 Fine	9 do 11	3	1

Należy upewnić się, że kolumna i wszystkie jej elementy są czyste i w dobrym stanie. Szczególnie ważne jest, aby siatki, elementy mocujące siatki i szklana rurka nie były uszkodzone. Należy używać dobrze odgazowanych buforów i wyrównać wszystkie materiały do temperatury, w której będzie przeprowadzana separacja. Kolumnę z wypełnieniem należy przechowywać z dala od miejsc narażonych na przeciągi lub bezpośrednie działanie promieni słonecznych, które mogą powodować zmiany temperatury i tworzenie się pęcherzyków powietrza. Objętość próbki może wynosić do 30% objętości kolumny. Zapakuj ilość pożywki do pięciokrotnej objętości próbki, która ma zostać odsolona.

Uwaga: Niniejsza instrukcja zakłada, że do pakowania używana jest kolumna z dwoma adapterami.

1. Odważ odpowiednią ilość suchego Sephadexu i pozwól pożywce spęcznieć zgodnie z powyższymi instrukcjami. Unikaj używania mieszadeł magnetycznych, szpatułek lub szklanych prętów, ponieważ mogą one uszkodzić pożywkę.
2. Zwilż dolny filtr, wstrzykując wodę destylowaną przez rurkę wylotową. Zamknij wylot części końcowej. Zamontuj filtr i dolny element końcowy na kolumnie.
3. Jeśli objętość zawiesiny jest większa niż objętość kolumny, przymocuj zbiornik uszczelniający do kolumny.
4. Zamontuj kolumnę i zbiornik uszczelniający pionowo na statywie laboratoryjnym.
5. Napełnij kolumnę wodą destylowaną lub buforem do wysokości około 2 cm powyżej elementu końcowego kolumny. Unikać pęcherzyków powietrza.
6. Wlać dobrze wymieszaną i dobrze odgazowaną zawiesinę w jednej operacji w dół wewnętrznej ściany za pomocą szklanego pręta. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
7. Podłącz wylot pompy do wlotu zbiornika uszczelniającego. Otwórz wylot kolumny i rozpocznij przepływ buforu. Przepuścić od 2 do 3 objętości buforu przez kolumnę w celu ustabilizowania złoża i całkowitego wyrównania. Użyj nieco wyższego natężenia przepływu niż natężenie przepływu, które ma być używane podczas separacji.
8. Utrzymaj natężenie przepływu wypełnienia przez co najmniej 3 objętości kolumny po uzyskaniu stałej wysokości złoża.
9. Zaznacz wysokość złoża na kolumnie i zamknij wylot kolumny. Usuń zbiornik wypełnienia.
10. Dodaj ostrożnie bufor, aby wypełnić kolumnę i utworzyć menisk skierowany ku górze.
11. Podłącz wszystkie rurki. Poluzuj mechanizm dokręcania adaptera i włóż adapter pod kątem do kolumny, aby powietrze nie zostało uwięzione pod siatką. Przesuwaj adapter powoli w dół kolumny, aż do osiągnięcia znaku. Należy pamiętać, że wylot adaptera powinien być otwarty, a wylot kolumny powinien być zamknięty.
12. Dostosuj mechanizm dokręcania, aby uzyskać uszczelnienie ślizgowe między ścianą kolumny a O-ringiem. Przykręć adapter do kolumny.
13. Kontynuuj pakowanie kolumny przez około 10 minut. Zatrzymaj pompę, zamknij wylot kolumny i przesuń górny adapter w dół na powierzchnię medium. Wsuń adapter na kolejne 3 mm w głąb medium. Kolumna jest teraz gotowa do wyrównania.

Sephadex G-10, G-25 i G-50 są zgodne z prawem Darcy'ego, to znaczy, że jeśli natężenie przepływu zostanie podwojone, to ciśnienie w kolumnie podwoi się, stąd maksymalne wartości natężenia przepływu lub ciśnienia roboczego nie muszą być brane pod uwagę (Załącznik 2 dla wyjaśnienia prawa Darcy'ego).

Rysunek A1.2 Pakowanie kolumnowe - Film przedstawia krok po kroku sposób pakowania kolumnowego.

Kontrolowanie natężenia przepływu

Najbezpieczniejszym i najłatwiejszym sposobem kontrolowania natężenia przepływu podczas pakowania kolumn i rozdzielania chromatograficznego jest użycie pompy sterowanej w systemie chromatograficznym ÄKTA. Dokładna i powtarzalna kontrola przepływu jest szczególnie ważna dla wydajnego pakowania kolumn oraz podczas powtarzania eksperymentów lub wykonywania rutynowych prac przygotowawczych. Pompa perystaltyczna może być używana z sefadeksem upakowanym w mniejszych kolumnach.

Maksymalne osiągalne natężenie przepływu zależy od średnicy kolumny i lepkości buforu. Wąskie kolumny pozwalają na wyższe ciśnienie i wyższy przepływ liniowy (cm/h) niż szerokie kolumny.

Zawsze podłączaj pompę tak, aby bufor był pompowany na kolumnę (zamiast podłączać pompę za kolumną i przeciągać bufor przez kolumnę). Zmniejsza to ryzyko tworzenia się pęcherzyków z powodu efektów ssania.

Zawsze używaj natężenia przepływu do pakowania kolumny, które jest wyższe niż natężenie przepływu używane do separacji.

Nie przekraczaj maksymalnych zalecanych wartości ciśnienia lub przepływu liniowego dla medium. Przekroczenie tych wartości może spowodować kompresję medium i zmniejszenie natężenia przepływu i rozdzielczości podczas separacji.

Nie przekraczać 75% natężenia przepływu wypełnienia podczas jakiejkolwiek separacji.

Nie używaj pompy perystaltycznej podczas pakowania nośników Superdex lub Sephacryl w większych kolumnach, ponieważ nie można osiągnąć wystarczająco wysokiego natężenia przepływu, aby uzyskać frakcjonowanie o wysokiej rozdzielczości.