Oczyszczanie przy użyciu sefarozy glutationowej^® High Performance, sefarozy glutationowej^® 4 Fast Flow i sefarozy glutationowej^® 4B

Te trzy podłoża chromatograficzne są używane do oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych GST i innych S-transferaz lub białek zależnych od glutationu. Umożliwiają one łagodne warunki elucji, które zachowują strukturę i funkcję białka. Wszystkie są dostarczane w postaci wstępnie spęcznionej w 20% etanolu i są również dostępne w różnych gotowych formatach, takich jak GSTrap, jak opisano w dalszej części tego rozdziału. Załącznik 2 (Charakterystyka produktów Glutathione Sepharose) dla głównych cech wszystkich nośników Glutathione Sepharose.

W Glutathione Sepharose High Performance ligand glutationowy jest sprzężony z wysoce usieciowaną 6% agarozą. Podłoże ma średnią wielkość kulek 34 µM i może być stosowane do oczyszczania o wysokiej rozdzielczości i elucji bardziej stężonej próbki.

W Glutathione Sepharose 4 Fast Flow ligand glutationowy jest sprzężony z silnie usieciowaną 4% agarozą. Średni rozmiar kulek wynosi 90 µM. Jest to dobry wybór do skalowania ze względu na dobrą zdolność wiązania i właściwości przepływu. Podłoże to nadaje się również do oczyszczania wsadowego i grawitacyjnego.

W Glutathione Sepharose 4B ligand glutationowy jest sprzężony z 4% agarozą. Średni rozmiar kulek wynosi 90 µM. Zapewnia bardzo wysoką zdolność wiązania i jest zalecana do oczyszczania na małą skalę, a także do operacji wsadowych i grawitacyjnych.

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow i Glutathione Sepharose 4B są również dostępne w opakowaniach jednostkowych na 96-dołkowych płytkach filtracyjnych.

Poniżej przedstawiono procedury oczyszczania białek znakowanych GST zarówno w trybie wsadowym, jak i kolumnowym.

Rysunek 5.3. Glutathione Sepharose High Performance, Glutathione Sepharose 4 Fast Flow i Glutathione Sepharose 4B do oczyszczania białek znakowanych GST.

Przygotowanie próbki

Przed rozpoczęciem tej procedury należy zapoznać się z ogólnymi uwagami dotyczącymi oczyszczania białek znakowanych GST.

Dostosować próbkę do składu i pH buforu wiążącego przez dodanie stężonych roztworów podstawowych; przez rozcieńczenie próbki buforem wiążącym; lub przez wymianę buforu.

Przepuścić próbkę przez filtr 0,22 µM lub 0,45 µM i/lub odwirować bezpośrednio przed zastosowaniem próbki. Jeśli próbka jest zbyt lepka, rozcieńczyć ją buforem wiążącym, aby zapobiec zatykaniu; zwiększyć obróbkę lizy (sonikacja, homogenizacja); lub dodać DNazę/RNazę, aby zmniejszyć rozmiar fragmentów kwasu nukleinowego.

Przygotowanie buforu

Używaj wody i chemikaliów o wysokiej czystości, a przed użyciem przefiltruj wszystkie bufory przez filtr 0,45 µM.

Bufor wiążący:	PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.3
Bufor elucyjny:	50 mM Tris-HCl, 10 mM zredukowany glutation, pH 8.0

1 do 20 mM DTT może być zawarte w buforach wiążących i elucyjnych w celu zmniejszenia ryzyka utleniania wolnych grup -SH na GST, co może powodować agregację znakowanego białka docelowego, co skutkuje niższą wydajnością białka znakowanego GST.

Oczyszczanie wsadowe białek znakowanych GST przy użyciu Glutathione Sepharose HP, Glutathione Sepharose 4 FF lub Glutathione Sepharose 4B

Podłoża do chromatografii Glutathione Sepharose są dostarczane wstępnie spęcznione w 20% etanolu. Pożywki są używane przy końcowym stężeniu zawiesiny wynoszącym 50%.

1. Określ objętość złoża sefarozy glutationowej wymaganą do oczyszczania.
2. Delikatnie wstrząśnij butelką, aby ponownie zawiesić zawiesinę.
3. Użyj pipety lub cylindra miarowego, aby usunąć wystarczającą ilość zawiesiny do użycia i przenieś ją do odpowiedniego pojemnika/probówki.
4. Osadź podłoże chromatograficzne przez wirowanie przy 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant.
5. Umyć sefarozę glutationową HP, FF lub 4B dodając 5 ml PBS na 1 ml zawiesiny (= 50% zawiesiny).

Podłoża z sefarozą glutationową muszą być dokładnie przemyte PBS w celu usunięcia roztworu do przechowywania etanolu, ponieważ pozostałości etanolu mogą zakłócać kolejne procedury.

6. Osadź podłoże chromatograficzne przez odwirowanie przy 500 × g przez 5 min. Ostrożnie zdekantuj supernatant.
7. Powtórz kroki 5 i 6 raz, aby uzyskać łącznie dwa płukania.

Informacje dotyczące czyszczenia, przechowywania i obsługi można znaleźć w Załącznik 2 (Charakterystyka produktów z sefarozy glutationowej).

Oczyszczanie wsadowe

1. Dodaj lizat komórkowy do przygotowanej pożywki z sefarozą glutationową i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, stosując delikatne mieszanie, takie jak obracanie od końca do końca.
2. Użyć pipety lub cylindra do przeniesienia mieszaniny do odpowiedniego pojemnika/rurki.
3. Osączyć podłoże przez odwirowanie z prędkością 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie zdekantuj supernatant (= przepływ) i zachowaj go do analizy SDS-PAGE, aby sprawdzić, czy nie nastąpiła utrata niezwiązanego białka docelowego.
4. Umyj pożywkę z sefarozą glutationową, dodając 5 ml PBS na 1 ml zawiesiny (= 50% zawiesiny). Odwrócić w celu wymieszania.
5. Sedymentować pożywkę przez wirowanie z prędkością 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant (= płukanie) i zachować go do analizy SDS-PAGE.
6. Powtórzyć kroki 4 i 5 dwa razy, w sumie trzy płukania.
7. Elucja związanego białka przez dodanie 0,5 ml buforu elucyjnego na 1 ml zawiesiny pożywki z sefarozą glutationową. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut, stosując delikatne mieszanie, takie jak obracanie od końca do końca.
8. Sedymentować pożywkę przez wirowanie przy 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie zdekantuj supernatant (= eluowane białko) i przenieś do czystej probówki.
9. Powtórz kroki 7 i 8 dwukrotnie, aby uzyskać łącznie trzy elucje. Sprawdź trzy eluaty oddzielnie pod kątem oczyszczonego białka i połącz te eluaty zawierające białko.

Oczyszczanie kolumnowe białek znakowanych GST przy użyciu Glutathione Sepharose HP,  Glutathione Sepharose 4 FF, lub Glutathione Sepharose 4B

Pakowanie kolumn

Zobacz instrukcje dołączone do produktów lub zapoznaj się z Załącznik 6 (Pakowanie i przygotowanie kolumn) w celu uzyskania ogólnych wytycznych dotyczących pakowania kolumn.

Purifikacja

Zalecane szybkości przepływu można znaleźć w Appendix 6 (Column packing and preparation), Table A6.6.

1. Wyrównać kolumnę za pomocą około 5 objętości buforu wiążącego.
2. Nałożyć wstępnie przygotowaną próbkę przy niskiej szybkości przepływu (około jednej trzeciej szybkości przepływu stosowanej podczas płukania i elucji).
3. Umyć kolumnę 5 do 10 objętościami buforu wiążącego lub do momentu, gdy w przepływie nie pojawi się żaden materiał. Zachowaj przepływ do analizy SDS-PAGE, aby sprawdzić, czy nie nastąpiła utrata niezwiązanego białka docelowego.
4. Elucja związanego białka za pomocą 5 do 10 objętości buforu elucyjnego. Zebrać frakcje i sprawdzić oddzielnie pod kątem oczyszczonego białka. Połączyć frakcje zawierające białko docelowe znakowane GST.