Oczyszczanie lub usuwanie albuminy i IgG

Albumina & IgG Depletion Sepharose High Performance

Albumina i IgG to najbardziej obfite białka w osoczu, które mają tendencję do przesłaniania sygnałów mniej obfitych białek, uniemożliwiając dokładne wykrywanie. Wysoka obfitość albuminy i IgG zakłóca również wykrywanie innych białek, uniemożliwiając włączenie do analizy wystarczającej ilości mniej obfitych białek. Pozbawiając próbki albuminy i IgG, można znacznie poprawić jakość i głębokość analizy. Pozbawienie tych dwóch białek usuwa ponad 60% całkowitej zawartości białka w ludzkim osoczu, umożliwiając wizualizację białek normalnie zasłoniętych przez albuminy i IgG.

Wysokowydajna sefaroza do usuwania albuminy i IgG jest dostępna w opakowaniach HiTrap^® i SpinTrap™ do usuwania albuminy surowicy ludzkiej (HSA) i IgG. Oba typy kolumn są wstępnie wypełnione mieszaniną anty-HSA Sepharose High Performance i Protein G Sepharose High Performance. Ligand anty-HSA Sepharose High Performance jest oparty na jednodomenowym fragmencie przeciwciała o wysokiej specyficzności i zdolności do HSA. Ligand Protein G Sepharose High Performance pochodzi z regionów wiążących IgG białka G, białka powierzchni komórki bakterii Streptococcus. Ligand białka G wiąże ludzkie IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

Podstawowym zastosowaniem produktów jest przygotowanie na małą skalę próbek białkowych przed dalszymi analizami, takimi jak elektroforeza żelowa 1-D lub 2-D i spektrometria mas (MS).

Podstawowym zastosowaniem produktów jest przygotowanie na małą skalę próbek białkowych przed dalszymi analizami, takimi jak elektroforeza żelowa 1-D lub 2-D i spektrometria mas (MS).

Niższa objętość próbki powinna być stosowana podczas stosowania osocza zawierającego albuminy i IgG powyżej normalnych poziomów ludzkiego osocza (40 mg albuminy / ml i 15 mg IgG / ml).

Charakterystyka pożywki chromatograficznej

Tabela 3.3 przedstawia charakterystykę pożywki chromatograficznej.

Tabela 3.3 Charakterystyka wysokowydajnego podłoża sefarozowego do usuwania albuminy i IgG

Produkt	Ligand	Skład	Stabilność pH1	Średnia wielkość cząsteczki (µM)
Albumina & IgG Depletion Sepharose High Performance	Rekombinowane białko G Fragment i rekombinowane białko G . i rekombinowane białko wiążące HSA	Ligand sprzężony z Sepharose High Performance.	Krótkoterminowa: 2 do 9 Długoterminowa: 3 do 9	34

¹ Krótkoterminowy odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia na miejscu i odkażania. Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym medium jest stabilne przez długi okres czasu bez negatywnego wpływu na jego późniejszą wydajność chromatograficzną.

Opcje oczyszczania

Opcje oczyszczania dla HiTrap^® Albumin & IgG Depletion oraz kolumny Albumin & IgG Depletion SpinTrap™ przedstawiono w
Tabeli 3.4.

Tabela 3.4 Opcje oczyszczania: HiTrap® Albumin & IgG Depletion oraz SpinTrap™ Albumin & IgG Depletion.

	Pojemność wiązania	Maksymalny przepływ roboczy szybkość przepływu (ml/min)	uwagi
HiTrap® Albumin & IgG Depletion	Osocze ludzkie, ~ 150 µL1	4	Opakowana kolumna 1 mL .
Albumina & IgG Depletion SpinTrap™	Osocze ludzkie, ~ 50 µL1	Nie dotyczy	Do stosowania z wirówką stacjonarną.

¹Osocze ludzkie zawierające ~ 40 mg albuminy/ml i ~ 15 mg IgG/ml. Wyniki zgodnie z testem ELISA: > 95% usunięcie albuminy i > 90% usunięcie IgG.

Przykłady oczyszczania

HiTrap^® Albumin & IgG Depletion może być stosowany do usuwania osocza ludzkiego bez rozcieńczania próbki przed załadowaniem. Objętość 150 µL ludzkiego osocza została naniesiona na kolumnę o pojemności 1 ml, a niezwiązana frakcja zawierająca zubożoną próbkę została zebrana. Pozbawienie albuminy i IgG pokazano za pomocą analizy SDS-PAGE (Rysunek 3.4). Poziom zubożenia określono również za pomocą testu ELISA, a wynik dla niezwiązanej frakcji wynosił 99% zubożenia albuminy i 98% zubożenia IgG.

Rysunek 3.4. Barwiona głęboką purpurą analiza SDS-PAGE (warunki nieredukujące) frakcji z usuwania ludzkiego osocza przy użyciu HiTrap® Albumin & IgG Depletion.

Wykonywanie separacji

Bufor wiążący: 20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7.4.

Bufor elucyjny: 100 mM glicyna-HCl, pH 2,7

Przygotowanie próbki: Rozcieńczanie ludzkiego osocza nie jest wymagane. Przefiltruj ludzkie osocze przez filtr 0,22 lub 0,45 µm na krótko przed nałożeniem go na kolumnę.

HiTrap^® Usuwanie albumin i IgG

Dla całej procedury usuwania zaleca się szybkość przepływu 1 ml/min.

1. Napełnij rurkę pompy buforem wiążącym. Zdejmij zatyczkę i odłamaną końcówkę z kolumny i podłącz ją do rurki pompy "kropla do kropli", aby uniknąć wprowadzenia powietrza do systemu.
2. Umyj kolumnę 5 ml buforu wiążącego, aby usunąć 20% roztwór do przechowywania etanolu.
3. Wyrównać za pomocą 10 ml buforu wiążącego.
4. Zastosować 150 µl filtratu ludzkiego osocza i przemyć co najmniej 5 ml buforu wiążącego, aż absorbancja osiągnie stałą wartość wyjściową. Zbierz przepływ próbki podczas jej nakładania i płukania. Przepływ zawiera zubożoną próbkę.
5. Opcjonalnie: Elucja i zebranie związanych białek (albuminy i IgG) za pomocą 10 ml buforu elucyjnego.

Uwaga: Krok 5 należy wykonać, jeśli kolumna ma być ponownie użyta lub jeśli związana frakcja albuminy i IgG ma być analizowana.

W przypadku ręcznej procedury usuwania (bez użycia pompy) strzykawka jest podłączona do kolumny za pomocą dostarczonego złącza Luer. Należy upewnić się, że szybkość przepływu wynosi około 1 ml/min.

Uwaga: zbyt wysoka szybkość przepływu spowoduje uszkodzenie uszczelnienia medium chromatograficznego i wysokie ciśnienie wsteczne.

Albumina & IgG Depletion SpinTrap™

1. Usuń roztwór do przechowywania
   • A. Odwrócić i wielokrotnie wstrząsnąć kolumną SpinTrap™ w celu ponownego zawieszenia pożywki.
   • B. Odkręć dolną nasadkę z kolumny SpinTrap™ i poluzuj górną nasadkę o jedną czwartą obrotu.
   • C. Umieść kolumnę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wiruj przez 30 s z prędkością 70-100 × g. Wyrzuć zebraną ciecz.
   • Zdejmij i wyrzuć górną nasadkę.
2. Równoważenie kolumny
   • A. Dodaj 400 µL buforu wiążącego i wiruj przez 30 s przy 800 × g. Odrzuć zebraną ciecz.
   • B. Dodaj 400 µL buforu wiążącego po raz drugi i wiruj przez 30 s przy 800 × g. Odrzuć zebraną ciecz.
3. Nałożenie próbki i inkubacja
   • A. Umieść kolumnę w nowej probówce o pojemności 2 ml.
   • B. Rozcieńczyć 50 µL próbki osocza buforem wiążącym do końcowej objętości 100 µL i nanieść na kolumnę.
   • C. Inkubować przez 5 minut bez mieszania.
4. Zbieranie zubożonej próbki
   • A. Wirować przez 30 s przy 800 × g. Zebrać eluat.
   • B. Dodaj 100 µL buforu wiążącego i wiruj przez 30 s przy 800 × g. Zbierz eluat.
   • C. Dodać 100 µL buforu wiążącego po raz drugi i wirować przez 30 s przy 800 × g. Zebrać eluat.
5. Opcjonalnie: elucja albuminy i IgG
   • A. Związane albuminy i IgG mogą być eluowane przez 100 mM glicynę-HCl, pH 2.7.

Przechowywanie

Przechowywać w temperaturze od 4 °C do 8 °C w 20% etanolu.

.