Oczyszczanie przy użyciu sefarozy kalmodulinowej 4B

Kalmodulina jest wysoce konserwatywnym białkiem regulatorowym występującym we wszystkich komórkach eukariotycznych. Białko to jest zaangażowane w wiele procesów komórkowych, takich jak metabolizm glikogenu, kontrola cytoszkieletu, neurotransmisja, aktywność fosforanowa i kontrola stosunku NAD⁺/NADP⁺. Calmodulin Sepharose 4B zapewnia wygodną metodę izolacji wielu białek wiążących kalmodulinę zaangażowanych w te szlaki.

Kalmodulina wiąże białka głównie poprzez ich interakcje z hydrofobowymi miejscami na jej powierzchni. Miejsca te są odsłonięte po zmianie konformacyjnej wywołanej działaniem Ca²⁺ na oddzielne miejsca wiążące Ca²⁺. Wiązanie enzymów może być wzmocnione, jeśli obecny jest substrat enzymu, a kompleksy enzym-substrat-kalmodulina-Ca²⁺ są szczególnie stabilne.

Opcje oczyszczania
	Pojemność wiązania/ml pożywki	Maksymalny przepływ roboczy	Komentarze
Calmodulin Sepharose 4B	Brak dostępnych danych	75 cm/h*	Dostarczana jako zawiesina gotowa do pakowania w kolumnie.

* Patrz Załącznik 4, aby przeliczyć przepływ liniowy (cm/h) na objętościowe natężenie przepływu. Maksymalny przepływ operacyjny jest obliczany na podstawie pomiaru w kolumnie z wypełnieniem o wysokości złoża 10 cm i średnicy wewnętrznej 5 cm.

Wykonywanie separacji

Bufor wiążący: 50 mM Tris-HCl, 0,05-0,2 M NaCl, 2 mM CaCl₂, pH 7,5

Bufor elucyjny: 50 mM Tris-HCl, 0,05-0,2 M NaCl, 2 mM EGTA, pH 7,5

1. Zapakuj kolumnę (Pakowanie i przygotowanie kolumny) i przemyć co najmniej 10 objętościami buforu wiążącego w celu usunięcia środka konserwującego.
2. Wyrównać kolumnę za pomocą 10 objętości buforu wiążącego.
3. Nałożyć próbkę, stosując niski przepływ od 15 cm / h, podczas nakładania próbki (szybkość przepływu jest najważniejszym czynnikiem dla maksymalnego wiązania).
4. Płukać 5-10 objętościami buforu wiążącego lub do momentu, gdy w eluencie nie pojawi się żaden materiał (monitorowany przez absorpcję UV przy A_{280 nm}).
5. Elutować 5 objętościami buforu elucyjnego.

Usuń proteazy tak szybko, jak to możliwe z próbki, ponieważ miejsca wiążące kalmodulinę na białkach są często bardzo podatne na działanie proteaz (Oczyszczanie lub usuwanie proteaz serynowych, np. trombiny i trypsyny oraz zymogenów).

Usuń wolną kalmodulinę z próbki za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofobowych w obecności Ca²⁺ na HiTrap Phenyl FF (high sub) lub za pomocą chromatografii jonowymiennej na HiTrap Q FF.

Ponieważ mogą wystąpić pewne niespecyficzne interakcje jonowe, zaleca się niskie stężenie soli (0,05-0,20 M NaCl) w celu promowania wiązania z ligandem przy jednoczesnym wyeliminowaniu wszelkich niespecyficznych wiązań.

Użyj środków chelatujących do elucji białek. Środki chelatujące usuwają Ca²⁺ z kalmoduliny, odwracając zmianę konformacyjną, która odsłoniła miejsca wiązania białka. Jony wapnia mogą być również wypierane przez wysokie stężenie soli, 1 M NaCl.

Czyszczenie

Alternatywa 1

Przemyć 3 objętościami kolumny 0,05 M Tris-HCl, 1,0 M NaCl, 2 mM EGTA, pH 7.5 i natychmiast ponownie wyrównać za pomocą 5-10 objętości kolumny buforu wiążącego.

Alternatywa 2

Płukać 3 objętościami kolumny 0,1 M buforu węglanu amonu, 2 mM EGTA, pH 8,6, a następnie 3 objętościami kolumny 1 M NaCl, 2 mM CaCl₂. Kontynuować płukanie 3 objętościami kolumny 0,1 M buforu octanu sodu, 2 mM CaCl₂, pH 4,4, a następnie 3 objętościami kolumny buforu wiążącego.

Usuń silne zanieczyszczenia przez płukanie niejonowym detergentem, takim jak 0,1% Triton X-100 w temperaturze +37 °C przez 1 min.

Charakterystyka nośnika

	Gęstość ligandu	Skład	Stabilność pH*	Średnia wielkość cząstek
Calmodulin Sepharose 4B	0.9-1.3 mg/ml	Kalmodulina jąder bydlęcych sprzężona z sefarozą 4B metodą CNBr.	Krótkoterminowe 4-9 Długoterminowe 4-9	90 µm

* Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym medium jest stabilne przez długi okres czasu bez negatywnego wpływu na jego późniejszą wydajność chromatograficzną. Krótkoterminowy odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia i sanityzacji.

Stabilność chemiczna

Stabilny we wszystkich powszechnie stosowanych roztworach wodnych.

Przechowywanie

Umyć nośniki i kolumny 20% etanolem (użyć około 5 objętości kolumn dla zapakowanych nośników) i przechowywać w temperaturze od +4 do +8 °C.

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch