Etapy i metoda sekwencjonowania Sangera

Co to jest sekwencjonowanie Sangera?

Sekwencjonowanie Sangera, znane również jako "metoda zakończenia łańcucha", jest metodą określania sekwencji nukleotydów DNA. Metoda ta została opracowana przez dwukrotnego laureata Nagrody Nobla Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 roku, stąd nazwa Sekwencjonowanie Sangera.

Aby zapoznać się z ogólną strukturą DNA, zobacz Rysunek 2.

Jak działa sekwencjonowanie Sangera?

Sekwencjonowanie Sangera może być wykonywane ręcznie lub, częściej, w sposób zautomatyzowany za pomocą maszyny sekwencjonującej (Rysunek 1). Każda metoda składa się z trzech podstawowych kroków opisanych poniżej.

Rysunek 1. Trzy podstawowe kroki automatycznego sekwencjonowania Sangera.

Kroki sekwencjonowania Sangera

Sekwencjonowanie Sangera składa się z trzech głównych etapów.

1. Sekwencja DNA do łańcuchowej amplifikacji PCR

Interesująca sekwencja DNA jest używana jako szablon dla specjalnego typu PCR zwany PCR z terminacją łańcucha. PCR z terminacją łańcucha działa tak samo jak standardowa PCR, ale z jedną zasadniczą różnicą: dodaniem zmodyfikowanych nukleotydów (dNTP) zwanych dideoksyrybonukleotydami (ddNTP). Na etapie wydłużania standardowego PCR, polimeraza DNA dodaje dNTP do rosnącej nici DNA poprzez katalizowanie tworzenia wiązania fosfodiestrowego między wolną grupą 3'-OH ostatniego nukleotydu a 5'-fosforanem następnego (Rysunek 2).

W PCR z terminacją łańcucha, użytkownik miesza niski stosunek ddNTP kończących łańcuch z normalnymi dNTP w reakcji PCR. ddNTP nie posiadają grupy 3'-OH wymaganej do tworzenia wiązania fosfodiestrowego; dlatego, gdy polimeraza DNA włącza losowo ddNTP, przedłużanie ustaje. Wynikiem PCR z terminacją łańcucha są miliony do miliardów kopii oligonukleotydów interesującej sekwencji DNA, zakończonych na losowych długościach (n) przez 5'-ddNTP.

W manualnym sekwencjonowaniu Sangera, przygotowywane są cztery reakcje PCR, z których każda zawiera tylko jeden rodzaj ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP i ddCTP).

W automatycznym sekwencjonowaniu Sangera, wszystkie ddNTP są mieszane w pojedynczej reakcji, a każdy z czterech dNTP ma unikalną etykietę fluorescencyjną.

2. Rozdzielanie wielkości za pomocą elektroforezy żelowej

W drugim etapie oligonukleotydy zakończone łańcuchem są rozdzielane według wielkości za pomocą elektroforezy żelowej. W elektroforezie żelowej próbki DNA są ładowane na jeden koniec matrycy żelowej i przykładany jest prąd elektryczny; DNA jest naładowane ujemnie, więc oligonukleotydy będą przyciągane w kierunku elektrody dodatniej po przeciwnej stronie żelu. Ponieważ wszystkie fragmenty DNA mają taki sam ładunek na jednostkę masy, prędkość, z jaką poruszają się oligonukleotydy, będzie zależeć tylko od ich wielkości. Im mniejszy jest fragment, tym mniejsze tarcie wystąpi podczas jego przemieszczania się przez żel i tym szybciej będzie się poruszał. W rezultacie oligonukleotydy będą ułożone od najmniejszego do największego, odczytując żel od dołu do góry.

W manualnym sekwencjonowaniu Sangera, oligonukleotydy z każdej z czterech reakcji PCR są uruchamiane w czterech oddzielnych pasach żelu. Dzięki temu użytkownik wie, które oligonukleotydy odpowiadają każdemu ddNTP.

W automatycznym sekwencjonowaniu Sangera, wszystkie oligonukleotydy są uruchamiane w pojedynczej elektroforezie w żelu kapilarnym w urządzeniu do sekwencjonowania.

3. Analiza żelu i określenie sekwencji DNA

Ostatni etap polega po prostu na odczytaniu żelu w celu określenia sekwencji wejściowego DNA. Ponieważ polimeraza DNA syntetyzuje DNA tylko w kierunku od 5' do 3', zaczynając od dostarczonego startera, każdy końcowy ddNTP będzie odpowiadał określonemu nukleotydowi w oryginalnej sekwencji (np, najkrótszy fragment musi kończyć się na pierwszym nukleotydzie od końca 5', drugi najkrótszy fragment musi kończyć się na drugim nukleotydzie od końca 5' itd.) Dlatego odczytując prążki żelu od najmniejszego do największego, możemy określić sekwencję od 5' do 3' oryginalnej nici DNA.

W manualnym sekwencjonowaniu Sangera, użytkownik odczytuje wszystkie cztery pasy żelu jednocześnie, przesuwając się od dołu do góry, używając pasa do określenia tożsamości końcowego ddNTP dla każdego pasma. Na przykład, jeśli dolne pasmo znajduje się w kolumnie odpowiadającej ddGTP, wówczas najmniejszy fragment PCR kończy się ddGTP, a pierwszy nukleotyd od końca 5' oryginalnej sekwencji ma zasadę guaniny (G).

W automatycznym sekwencjonowaniu Sangera komputer odczytuje każde pasmo żelu kapilarnego w kolejności, wykorzystując fluorescencję do określenia tożsamości każdego końcowego ddNTP. Krótko mówiąc, laser wzbudza znaczniki fluorescencyjne w każdym paśmie, a komputer wykrywa emitowane światło. Ponieważ każdy z czterech ddNTP jest oznaczony inną etykietą fluorescencyjną, emitowane światło może być bezpośrednio powiązane z tożsamością końcowego ddNTP. Wynik jest nazywany chromatogramem, który pokazuje fluorescencyjny pik każdego nukleotydu wzdłuż długości matrycowego DNA.

Rysunek 2. Schemat struktury DNA. DNA to cząsteczka składająca się z dwóch nici, które zwijają się wokół siebie, tworząc podwójną helisę. Każda nić składa się z łańcucha cząsteczek zwanych dezoksyrybonukleotydami (dNTP).

Każdy dNTP zawiera grupę fosforanową, grupę cukrową i jedną z czterech zasad azotowych [adeninę (A), tyminę (T), guaninę (G) lub cytozynę (C)]. DNTP są połączone ze sobą w sposób liniowy za pomocą wiązań kowalencyjnych fosfodiestrowych między cukrem jednego dNTP a grupą fosforanową następnego; ten powtarzający się wzór cukrowo-fosforanowy tworzy szkielet cukrowo-fosforanowy.

Zasady azotowe dwóch oddzielnych nici są połączone wiązaniami wodorowymi między komplementarnymi zasadami, tworząc dwuniciową helisę DNA.

Jak odczytywać wyniki sekwencjonowania Sangera

Prawidłowe odczytanie wyników sekwencjonowania Sangera zależy od tego, która z dwóch komplementarnych nici DNA jest interesująca i jaki starter jest dostępny. Jeśli dwie nici DNA to A i B, a nić A jest interesująca, ale starter jest lepszy dla nici B, fragmenty wyjściowe będą identyczne z nicią A. Z drugiej strony, jeśli nić A jest interesująca, a starter jest lepszy dla nici A, wówczas wynik będzie identyczny z nicią B. W związku z tym dane wyjściowe muszą zostać przekonwertowane z powrotem na nić A.

Tak więc, jeśli sekwencja zainteresowania brzmi "TACG", a starter jest najlepszy dla tej nici, dane wyjściowe będą "ATGC", a zatem muszą zostać przekonwertowane z powrotem na "TACG". Jeśli jednak starter jest lepszy dla nici komplementarnej ("ATGC"), wynikiem będzie "TACG", co jest prawidłową sekwencją.

Krótko mówiąc, przed rozpoczęciem musisz wiedzieć, na co celujesz i jak zamierzasz się tam dostać! Mając to na uwadze, oto przykład pierwszego przykładu (TACG -> ATGC -> TACG). Jeśli etykiety dideoksynukleotydów są T = żółte, A = różowe, C = ciemnoniebieskie i G = jasnoniebieskie, otrzymasz krótkie sekwencje primer-A, primer-AT, primer-ATG i primer-ATGC. Gdy fragmenty zostaną rozdzielone przez elektroforezę, laser odczyta fragmenty w kolejności długości (różowy, żółty, jasnoniebieski i ciemnoniebieski) i utworzy chromatogram. Komputer przekonwertuje litery, więc ostateczna sekwencja jest poprawna TACG.

Sekwencjonowanie Sangera vs. PCR

Sekwencjonowanie Sangera i PCR wykorzystują podobne materiały wyjściowe i mogą być używane w połączeniu ze sobą, ale żadne z nich nie może zastąpić drugiego.

PCR służy do amplifikacji DNA w całości. Podczas gdy fragmenty o różnej długości mogą być wytwarzane przez przypadek (np. polimeraza DNA może spaść), celem jest powielenie całej sekwencji DNA. W tym celu "składnikami" są docelowe DNA, nukleotydy, starter DNA i polimeraza DNA (w szczególności polimeraza Taq, która może przetrwać wysokie temperatury wymagane w PCR).

W przeciwieństwie do tego, celem sekwencjonowania Sangera jest wygenerowanie każdej możliwej długości DNA aż do pełnej długości docelowego DNA. Dlatego też, oprócz materiałów wyjściowych PCR, niezbędne są dideoksynukleotydy.

Sekwencjonowanie Sangera i PCR można połączyć podczas generowania materiału wyjściowego dla protokołu sekwencjonowania Sangera. PCR może być używany do tworzenia wielu kopii DNA, które ma być sekwencjonowane.

Mając więcej niż jeden szablon do pracy, protokół Sangera jest bardziej wydajny. Jeśli sekwencja docelowa ma długość 1000 nukleotydów i istnieje tylko jedna kopia matrycy, wygenerowanie 1000 oznakowanych fragmentów zajmie więcej czasu. Jeśli jednak istnieje kilka kopii szablonu, teoretycznie wygenerowanie wszystkich 1000 oznaczonych fragmentów zajmie mniej czasu.