Histopaque^® Nośnik o gradiencie gęstości Instrukcja rozwiązywania problemów

Mark Frei

Następujące zalecenia dotyczące rozwiązywania problemów związanych z użyciem Histopaque i ACCUSPIN™ w technikach separacji komórek zostały opracowane przez naszych naukowców z Działu Wsparcia Technicznego w oparciu o obserwacje i doświadczenie zdobyte podczas rozwiązywania problemów klientów. Niniejszy przewodnik odnosi się do najczęstszych źródeł błędów zaobserwowanych podczas korzystania z Histopaque, ale nie stanowi wyczerpującej listy.

Typowe problemy zaobserwowane podczas stosowania Histopaque/ACCUSPIN
Porady dotyczące rozwiązywania problemów z próbkami krwi lub komórek
Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z użyciem Histopaque/ACCUSPIN
Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z użyciem techniki
Materiały

Typowe problemy zaobserwowane podczas stosowania Histopaque/ACCUSPIN

• Trudności w oddzielaniu komórek jednojądrzastych lub polimorfojądrzastych z krwi ludzkiej
• Trudności w oddzielaniu komórek jednojądrzastych lub polimorfojądrzastych z krwi szczurów lub myszy
• Niski odzysk
• Trudności w oddzielaniu komórek jednojądrzastych lub polimorfojądrzastych z krwi szczurów lub myszy
• Niski odzysk
• Zanieczyszczenie krwinek czerwonych, płytek krwi lub neutrofili w oddzielonych komórkach

Porady dotyczące rozwiązywania problemów z próbkami krwi lub komórek

Przyczyna	Rozwiązanie
Krew pobrana >24 godziny przed separacją	Użyj krwi pobranej od 2 do 6 godzin przed separacją. Krew pobrana w ciągu 24 godzin będzie trudniejsza do oddzielenia, a procent odzysku i żywotność będą niższe.
Krew uległa koagulacji z powodu braku antykoagulantu	Zaleca się stosowanie probówek próżniowych z odmierzoną ilością antykoagulantu. Użycie strzykawki (bez antykoagulantu) nie jest zalecane.
Krew uległa koagulacji z powodu niepełnego wymieszania	Sprawdź, czy probówki próżniowe z antykoagulantem są dobrze wymieszane po pobraniu krwi.
Używany antykoagulant nie nadaje się do stosowania w separacji Histopaque	Następujące antykoagulanty nadają się do stosowania z Histopaque:      - 15-30 jednostek heparyny na ml krwi pełnej       - 1.25-1,75 mg EDTA na ml krwi pełnej ACA-A (Acid Citrate Dextrose formula A) może być stosowany jako antykoagulant. Po oddzieleniu, pasmo komórek jednojądrzastych będzie szersze niż w przypadku innych antykoagulantów. Jest to normalne i komórki mogą być użyte.
Próbka krwi jest zbyt ciepła i separacja została przeprowadzona zbyt szybko po pobraniu krwi	Zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami może być wynikiem tego, że krew nie ma temperatury pokojowej. Po pobraniu krew powinna ostygnąć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30-45 minut. Jeśli zostanie użyta natychmiast po pobraniu, liczba pobranych komórek jednojądrzastych będzie niska. Procedury separacji są optymalne, gdy zarówno krew, jak i Histopaque mają temperaturę 18-20°C, z dopuszczalnym zakresem temperatur 18-26°C.
Próbka krwi rozcieńczona PBS o wysokim stężeniu soli	Historyczna technika separacji komórek stosowana z Histopaque obejmuje rozcieńczenie krwi PBS (1:1). Następnie stwierdziliśmy, że nie wszystkie preparaty PBS są odpowiednie do stosowania z Histopaque. Roztwory zawierające 150 mM bufor fosforanowy i 150 mM chlorek sodu to roztwory PBS o stężeniu soli zbyt wysokim do stosowania z Histopaque. Wartości molowe PBS bliższe 10 mM fosforanu są bardziej odpowiednie do stosowania z Histopaque. Żywotność komórek pozostanie wyższa, gdy PBS o wysokim stężeniu soli zostanie zastąpiony odpowiednim podłożem do hodowli komórkowej.
Różnice w fizjologii krwi dawcy (gdy pojedyncza próbka ma gorszy odzysk)	Wysoki poziom lipidów, czynnik reumatoidalny, niedokrwistość i leczenie farmakologiczne są możliwymi przyczynami słabej separacji krwi konkretnego dawcy. Jeśli osocze nie jest klarowne, wskazuje to na wysoki poziom lipidów.
Zanieczyszczenie próbki małego zwierzęcia innymi płynami lub ciałami stałymi	Krew uzyskana z krwawienia bezigłowego, np, poprzez pobranie próbki z ogona, jest często niedopuszczalna do użycia ze względu na obecność sierści i innych płynów ustrojowych w pobranej krwi. Często powoduje to uruchomienie kaskady krzepnięcia, powodując krzepnięcie. Zaleca się uśmiercenie zwierzęcia i pobranie krwi przez aortę lub żyłę główną lub inne duże naczynie krwionośne. Alternatywnie, do pobierania krwi można użyć pediatrycznej rurki próżniowej.
Okluzja białych krwinek w próbkach o wysokim poziomie białych krwinek	Agregaty mogą tworzyć się, gdy czerwone krwinki wchodzą w kontakt z polisacharozą, powodując okluzję białych krwinek. Po uwięzieniu w tych agregatach białe krwinki przemieszczają się na dno probówki wirówki. W przypadku rutynowych próbek krwi procent odzysku będzie często wyższy w przypadku nierozcieńczonej krwi. Jednak szpik kostny, krew pępowinowa i próbki od dawców z nienormalnie wysoką liczbą białych krwinek powinny być rozcieńczone, aby zmniejszyć rozmiar agregatów czerwonych krwinek i poprawić odzysk białych krwinek.
Nieprawidłowe rozcieńczenie krwi lub rozcieńczenie zanieczyszczonym PBS lub pożywką	.Gdy krew jest rozcieńczana przed załadowaniem na Histopaque®, istnieje prawdopodobieństwo, że bufor lub pożywka są niekompatybilne z Histopaque lub że PBS lub pożywka do hodowli komórkowej są zanieczyszczone. Jeśli krew została rozcieńczona, a wydajność jest niska, należy powtórzyć eksperyment bez rozcieńczania próbki.
Rozcieńczanie przy użyciu pożywki do hodowli komórkowych zawierającej FBS lub inne białko nośnikowe	Podłoże do hodowli komórkowych bez FBS można zastąpić PBS podczas rozcieńczania próbek do użycia z Histopaque. Jeśli krew zostanie rozcieńczona pożywką do hodowli komórkowych zawierającą FBS, liczba odzyskanych komórek będzie niższa. FBS można dodać do pożywki do hodowli w celu późniejszego płukania lub przechowywania po oddzieleniu komórek i co najmniej jednokrotnym płukaniu w celu usunięcia Histopaque. Po pierwszym płukaniu, dodanie białka takiego jak FBS do pożywki do płukania dodatkowo ochroni komórki przed uszkodzeniem.
Izolacja komórek z kożuszków przy użyciu Histopaque	Kożuszek jest przygotowywany poprzez pobranie krwi w odpowiednim antykoagulancie i odwirowanie. Czerwone krwinki opadną na dno probówki. Bezpośrednio na wierzchu warstwy czerwonych krwinek pojawi się szara warstwa. Ta szara warstwa to kożuch i reprezentuje wszystkie białe krwinki we krwi. Powyżej szarej warstwy będzie znajdować się osocze. Płaszcze buffy przygotowane ze świeżej krwi nadają się do separacji przy użyciu Histopaque. Jeśli komórki mają kilka dni, np, jeśli kożuszki są uzyskane z oddanych jednostek krwi, komórki mogą nie zapewnić akceptowalnej wydajności. Kożuszki muszą być rozcieńczone minimum 1:2 lub 1:4 przed załadowaniem do gradientu Histopaque.
Izolacja komórek z kożuszków przy użyciu probówek ACCUSPIN™	Preparaty z kożuszków nie mogą być używane w probówkach ACCUSPIN. Probówki ACCUSPIN wymagają określonej ilości czerwonych krwinek do prawidłowego działania, a kożuszki nie zawierają wystarczającej ilości czerwonych krwinek do użycia w probówkach ACCUSPIN.

Porady dotyczące rozwiązywania problemów z histopaque/ACCUSPIN

Przyczyna	Rozwiązanie
Zanieczyszczenie bakteryjne preparatu Histopaque	Histopaque jest produkowany jako sterylny roztwór. Nie zawiera konserwantów zmniejszających ryzyko zanieczyszczenia. Jeśli podejrzewa się zanieczyszczenie, należy użyć świeżej butelki Histopaque.
Temperatura Histopaque jest zbyt niska	Jeśli Histopaque lub napełnione probówki ACCUSPIN są używane w niskiej temperaturze, wydajność jest zazwyczaj bardzo niska i można zaobserwować zlepianie się komórek. Zanieczyszczenie krwinek czerwonych może również wynikać z tego, że Histopaque nie ma temperatury pokojowej. Temperatura jest niezwykle ważna podczas wykonywania procedury. Butelka Histopaque o pojemności 100 ml lub 500 ml przechowywana w temperaturze 2-8°C może potrzebować kilku godzin, aby osiągnąć temperaturę 18-20°C. Planując użycie Histopaque, zalecamy wyjęcie Histopaque z lodówki poprzedniego dnia i pozostawienie butelek na noc na stole. Dzięki temu roztwór będzie miał temperaturę pokojową i będzie gotowy do użycia. Inną opcją jest przeniesienie odpowiedniej ilości Histopaque do każdej wirówki lub probówki ACCUSPIN i pozostawienie mniejszych objętości do aklimatyzacji do temperatury pokojowej. Po zebraniu pasma komórek i wykonaniu pierwszego płukania, dopuszczalne jest wykonanie pozostałych etapów płukania w temperaturze 4°C.

Porady dotyczące rozwiązywania problemów z techniką

Przyczyna	Rozwiązanie
Opóźnienie w przetwarzaniu próbek po nałożeniu krwi na Histopaque	Podczas nakładania krwi na gradienty przeznaczone dla komórek jednojądrzastych, precyzyjne nakładanie warstw nie jest wymagane. Jeśli dojdzie do niewielkiego wymieszania krwi i Histopaque, pasmo komórek nadal będzie formować się prawidłowo. Po nałożeniu warstw krwi ważne jest, aby natychmiast umieścić probówki wirówkowe w wirówce. Jeśli upłynie zbyt dużo czasu, cała warstwa Histopaque będzie zabarwiona na czerwono od czerwonych krwinek. W zależności od ilości "tworzenia się kropli" może to obniżyć procent odzysku komórek jednojądrzastych. Liczba probówek przetwarzanych jednocześnie powinna być ograniczona, aby zmniejszyć rozproszenie komórek.
Nieprawidłowe nakładanie warstw Histopaque® 1077 i Histopaque 1119 podczas izolacji neutrofili./td>	W przypadku stosowania zarówno Histopaque 1077, jak i Histopaque 1119 do izolacji neutrofili, należy zastosować ostrożną technikę, aby zapobiec mieszaniu się na granicy faz roztworu. Sprawdź integralność interfejsu za pomocą optyki Schlierena. Wszelkie zawirowania lub mieszanie na granicy między warstwami powinny być widoczne podczas trzymania probówki pod światło. Jeśli interfejs został prawidłowo przygotowany, powinna istnieć ostro zarysowana linia. Jeśli nie ma ostro zdefiniowanej linii lub jeśli na interfejsie występuje wirowanie, należy wyrzucić rurkę i zacząć od nowa. Ważne jest również, aby użyć gradientu, gdy tylko zostanie utworzony. Nie ma różnic chemicznych między 1077 i 1119; oba roztwory mają te same składniki i z czasem zaczną dyfundować razem. Gdy tak się stanie, odzysk będzie słaby lub żaden.
Zanieczyszczenie proszkiem używanym w sproszkowanych rękawiczkach	Nie należy używać sproszkowanych rękawiczek. Puder w rękawicach powoduje agregację komórek. Należy używać wyłącznie rękawic bezpudrowych.
Nieprawidłowa siła wirowania	Wirówka powinna zostać sprawdzona w celu zapewnienia prawidłowej kalibracji. Nadmierna siła (wyższa prędkość wirowania) obniży wydajność.
Histopaque była sterylizowana w autoklawie przed użyciem	Histopaque nie może być sterylizowana w autoklawie; autoklawowanie spowoduje karmelizację polisacharozy w roztworze, zmieniając jej kolor na brązowy. Dopuszczalne jest sterylne filtrowanie Histopaque przez filtr 0,22 mikrona.
Zanieczyszczenie płytek krwi lub neutrofilów w komórkach po oddzieleniu	Zanieczyszczenie płytek krwi lub neutrofilów jest zazwyczaj wynikiem pobrania zbyt dużej ilości osocza lub Histopaque 1077 lub 1083 podczas pobierania pasma komórek. Zmniejsz ilość pobieranego osocza lub Histopaque.
Zbyt duża objętość użyta do płukania osadu komórkowego	Płukanie osadu komórkowego zazwyczaj usuwa płytki krwi. Jeśli duża ilość roztworu płuczącego pozostanie nad osadem komórkowym, spowoduje to większą ilość płytek krwi w zawiesinie komórkowej. Usuń jak najwięcej roztworu płuczącego bez naruszania osadu komórkowego. Płytki krwi zwykle nie osiadają poniżej siły wirowania 1000 × g  przez 10 minut. Przy niższych prędkościach wirowania zalecanych dla etapów płukania, płytki krwi powinny pozostać zawieszone w medium płuczącym lub supernatancie.
Peellet komórkowy nie tworzy zawiesiny pojedynczych komórek	Podczas ponownego zawieszania peletu komórkowego należy użyć tylko niewielkiej ilości roztworu płuczącego. Zalecamy nie więcej niż 0,5 ml roztworu płuczącego podczas wykonywania procedury w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml. Roztwór płuczący jest delikatnie przepłukiwany nad osadem. Może być konieczne kilkakrotne wciągnięcie zawiesiny komórek do pipety i dozowanie. Gdy komórki znajdą się w zawiesinie jednokomórkowej, można dodać pozostały roztwór płuczący i odwirować roztwór.
Utrata komórek podczas płukania z powodu przylegania do ścianek probówki wirówkowej	Okazjonalnie komórki przylegają do ścianek probówki wirówkowej. Jeśli komórki przylgną do polistyrenowej probówki, probówka stanie się mętna. Wymień na inną partię polistyrenowych probówek wirówkowych lub zmień na inny rodzaj plastiku, taki jak polietylen. Najczęściej obserwuje się występowanie tego problemu w probówkach polistyrenowych, ale inne rodzaje plastiku również mogą powodować przyleganie komórek.