HSAMPURO

Zestaw biblioteki lentiwirusowej całego genomu ludzkiego SAM CRISPRa Puro

• Synonim(y): Biblioteka SAM CRISPRa, Ludzka biblioteka CRISPRa
• NACRES: NA.51
• UNSPSC Code: 41106621

Właściwości

• packaging: pkg of 40 vials (8x25μL aliquots for each of the 5 kit components)
• application(s): CRISPR
• shipped in: dry ice
• storage temp.: −70°C

Opis

General description

Aktywator transkrypcyjny VP64 połączony z nukleazą SpCas9 (dCas9) tworzy kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) z RNA-przewodnikiem CRISPR (gRNA). Sekwencje łodygi i tetra-pętli w rusztowaniu gRNA zostały zmodyfikowane w minimalne aptamery RNA spinki do włosów, które selektywnie wiążą dimeryzowane białka płaszcza bakteriofaga MS2. Białko płaszcza MS2 jest połączone z podjednostką p65 NF-kappaB (NFκB) i domeną aktywacyjną ludzkiego czynnika szoku cieplnego 1 (HSF1). Prowadnica RNA zawiera dwa aptamery, z których każdy może wiązać dwa białka koaktywatora MS2, skutecznie rekrutując cztery koaktywatory dla każdego kompleksu aktywatora celującego CRISPR.

Konstrukty pomocnicze dCas9-VP64, MS2-p65-HSF1 i gRNA są dostarczane jako trzy oddzielne plazmidy/cząsteczki lentiwirusowe. W przeciwieństwie do macierzowych bibliotek gRNA zawierających każdy klon w osobnym dołku na płytce, zbiorcze biblioteki gRNA zawierają tysiące pojedynczych gRNA w jednej probówce, umożliwiając wydajne przesiewanie całego ludzkiego genomu (ponad 16 000 genów) na stole laboratoryjnym bez robotyki lub specjalistycznego sprzętu. Biblioteka SAM CRISPR jest dostarczana w 3 pulach. Każda pula zawiera około 23 500 gRNA, z 3 gRNA na RefSeqID. Biblioteka całego genomu zawiera łącznie około 70 000 gRNA ukierunkowanych na 19 000 unikalnych symboli genów (w tym alternatywne izoformy obejmujące 23 500 RefSeqID).

W każdej puli znajduje się 100 niecelujących (tj. negatywnych) kontrolnych gRNA do wykorzystania jako punkt odniesienia w statystycznej charakterystyce zmian częstotliwości gRNA mierzonych przez głębokie sekwencjonowanie. Negatywne gRNA kontrolne mają minimalną homologię z genomem docelowym i nie powinny ulegać znaczącym zmianom w reprezentacji podczas leczenia komórek kontrolnych. Ze względu na charakter eksperymentów przesiewowych z aktywatorami CRISPR, kontrole pozytywne muszą być określane empirycznie, biorąc pod uwagę specyficzny fenotyp, który ma być badany na ekranie. Łącznie kontrole te stwarzają wiele możliwości wcześniejszego projektowania eksperymentów i późniejszej analizy danych.

Biochem/physiol Actions

Systemy CRISPR/Cas są wykorzystywane przez bakterie i archeony do obrony przed inwazją wirusów i plazmidów. Niedawno system CRISPR/Cas typu II z bakterii Streptococcus pyogenes został zaprojektowany do funkcjonowania w systemach eukariotycznych przy użyciu dwóch składników molekularnych: pojedynczego białka Cas9 i niekodującego RNA (gRNA). Endonukleaza Cas9 może być nieaktywna (dCas9) z mutacjami w dwóch domenach białkowych, RuvC i HnH (odpowiednio D10A i H840A), które są odpowiedzialne za aktywność nukleazy. Białko z niedoborem nukleazy można następnie połączyć z aktywatorem transkrypcyjnym VP64 i wykorzystać w połączeniu z RNA-przewodnikiem zmodyfikowanym aptamerami MS2 RNA, które działają w celu rekrutacji dodatkowych koaktywatorów transkrypcyjnych p65 i HSF1. Zmontowany kompleks SAM jest następnie wykorzystywany jako system dostarczania ładunku do docelowych promotorów genów, umożliwiając specyficzną dla miejsca aktywację transkrypcji interesującego nas genu.

Features and Benefits

• Wysoka specyficzność i aktywność
• Cząsteczki lentiwirusowe o wysokiej czystości i wysokim mianie, zweryfikowane pod względem sekwencji
• Aktywuje geny poprzez aktywację transkrypcyjną zamiast nadekspresji opartej na cDNA

Dowiedz się więcej o aktywatorach SAM CRISPR na stronie SigmaAldrich.com/CRISPRa.

Other Notes

VP/ml jest jednostką miary stężenia dla miana wirusa oszacowanego za pomocą testu p24.

This kit contains 5 components:

2 Helper Constructs with a minimum concentration of 1x10⁶ VP/mL(via p24 assay)

• 8 x 25μl vials of dCas9-VP64-Blasticidin SAM CRISPRa Helper Construct 1 Lentiviral Transduction Particles
• 8 x 25μl vials of MS2-P65-HSF1-Hygromycin SAM CRISPRa Helper Construct 2 Lentiviral Transduction Particles

3 Subpools with a minimum conecentration of 5x10⁸ VP/mL(via p24 assay)

• 8 x 25μl vials of Human SAM CRISPRa Library Pool 1 - Puro
• 8 x 25μl vials of Human SAM CRISPRa Library Pool 2 - Puro
• 8 x 25μl vials of Human SAM CRISPRa Library Pool 3 - Puro

Legal Information

Umowa licencyjna na użytkowanieCRISPR

Licencje na fluorofory Lentiviral, WPRE i Evrogen

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids