HPLC de grosses molécules

HPLC en phase inverse

La HPLC en phase inverse (RP-HPLC) est une technique sensible et polyvalente utilisée pour séparer et analyser les protéines, les fragments protéiques et les peptides. La RP-HPLC emploie sur une phase stationnaire non polaire et une phase mobile polaire. La rétention des protéines et des peptides sur la phase stationnaire suit les principes d'adsorption et de séparation. Les régions hydrophobes des protéines se fixent de manière réversible à la phase stationnaire. L'élution des protéines est provoquée par l'augmentation de la nature non polaire de la phase mobile. La résolution peut être affectée par la taille des pores, la taille des particules, la longueur de la colonne et le type de la chaîne hydrocarbonée fixée à la phase stationnaire.

Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)

La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est un mode chromatographique non dénaturant qui sépare les molécules en fonction de leur taille (ou plus exactement de leur rayon hydrodynamique). Ce mode repose non pas sur l'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire, mais plutôt sur l'écoulement aléatoire de l'analyte entre les particules de la phase stationnaire. Les analytes de haute masse moléculaire sont élués en premier, car ils sont partiellement voire totalement exclus des pores des particules de la phase stationnaire ; les analytes de basse masse moléculaire, quant à eux, sont élués plus lentement, car ils passent plus de temps à parcourir les chemins tortueux entre particules. La SEC permet de caractériser les agrégats et les fragments d'anticorps monoclonaux (AcM ou mAb), d'estimer la masse moléculaire des protéines non identifiées et de déterminer la stabilité des formulations de protéines.

Chromatographie hydrophobe (HIC)

La chromatographie hydrophobe (HIC) est un mode chromatographique qui permet de séparer les analytes en fonction du degré d'interaction entre les parties hydrophobes des analytes et les ligands hydrophobes de la phase stationnaire. De par la faible masse moléculaire des peptides et leur moindre propension à se replier, la HIC n'est généralement pas utilisée pour séparer ce type de composé. La présence de fortes concentrations en sels peut suffisamment perturber les couches d'hydratation des protéines pour qu'une interaction s'établisse entre les régions hydrophobes de surface et la phase stationnaire non polaire. Le choix des sels à utiliser est dicté par la série Hofmeister (ou série lyotropique), qui classe les cations et les anions en fonction de leur capacité à perturber les couches d'hydratation des protéines (effet chaotropique) ou à faciliter la formation de couches d'hydratation autour des protéines (effet cosmotrope). Les sels employés sont typiquement le sulfate d'ammonium, le sulfate de potassium et le sulfate de sodium. La chromatographie hydrophobe sert actuellement à déterminer le profil du rapport médicament/anticorps (DAR) des conjugués anticorps-médicament (ADC).

Chromatographie à échange d'ions (IEX)

La chromatographie d'échange d'ions (IEX) est un mode chromatographique qui permet de séparer les analytes en fonction de leur charge. Les protéines et les peptides sont amphotères, c'est-à-dire qu'ils comportent des fonctionnalités acides et basiques. Les fonctionnalités acides des protéines sont par exemple l'acide aspartique, l'acide glutamique, la cystéine, la tyrosine et l'α-carboxylate C-terminal. Les fonctionnalités basiques des protéines sont par exemple l'arginine, l'histidine, la lysine et l'α-amine N-terminale. Les variants de charge des composés biothérapeutiques peuvent être détectés et séparés par IEX. L'apparition de variants de charge peut être due à une erreur de traduction du produit de transcription de l'ARN messager (ARNm) et/ou à des modifications post-traductionnelles, telles que la désamidation, l'oxydation, ou la glycosylation.

La colonne d'IEX doit être choisie en fonction du point isoélectrique (pI) de l'analyte.  Si le pH de la phase mobile est inférieur au pI, l'analyte porte une charge positive et se lie à une colonne échangeuse de cations.  Si le pH de la phase mobile est supérieur au pI, l'analyte porte une charge négative et se lie à une colonne échangeuse d'anions.

Chromatographie d'affinité

La chromatographie d'affinité repose sur une interaction spécifique entre un analyte et un ligand de la phase stationnaire. Dans l'idéal, seul l'analyte d'intérêt interagit avec la phase stationnaire, tous les autres constituants de l'échantillon traversant la colonne sans s'y fixer. Une seconde phase mobile est ensuite introduite dans la colonne pour éluer l'analyte.

La chromatographie avec protéine A est la forme de chromatographie d'affinité la plus couramment employée dans l'industrie biopharmaceutique.  La protéine A est une protéine de surface de 42 kDa présente dans la paroi cellulaire de S. aureus.  Cette protéine se fixe spécifiquement à la chaîne lourde de la région Fc des IgG, ce qui en fait un mécanisme idéal pour séparer les IgG des autres constituants de l'échantillon.  La plupart des colonnes avec protéine A sont fabriquées en immobilisant la protéine sur une particule organique poreuse.  Un format monolithique de chromatographie avec protéine A a néanmoins été produit : il offre une grande cadence d'analyse à différents débits, sans pour autant sacrifier l'efficacité.